Μελέτη της επίδρασης των πρωτεϊνών με αμυλοειδή χαρακτηριστικά στην παθογένεια και εξέλιξη των νευροεκφυλιστικών νόσων

Abstract

α-Synuclein, α small neuronal protein enriched in synaptic terminals, is biochemically and genetically linked to Parkinson's disease. α-Synuclein is the main protein component of Lewy bodies and neurites, which are the major pathological hallmarks of Parkinson's disease and other synucleinopathies. Many studies suggest that the selective a-Synuclein accumulation in proteinaceous inclusions, emerge as a result of unfolded monomeric α-Synuclein conversion to dimers and progressively to stable fibrilar structures. A growing body of evidence highlights the causative role of a-Synuclein secretion and cell-to-cell transmission in disease pathogenesis and progression. However, the mechanism of a-Synuclein accumulation in fibrilar structures in vivo remains elusive. a-Synuclein is subjected to several post-translational modifications (PTMs), that affect the solubility and the oligomerization of the protein. Among these PTMs, a growing interest has been focused on the phosphorylation at residue S129. Nearly all α-Synuclein accumulated within Lewy bodies is phosphorylated on serine 129 (Ser-129), but the significance of phosphorylation in the biology and pathophysiology of the protein is still controversial. Although the phosphorylation state of α-Synuclein appears to influence its aggregation propensity and toxicity, it is still not known whether phosphorylation promotes or prevents the aggregation and toxicity of α-Synuclein.To clarify a role of Ser129 phosphorylation of α-Synuclein in pathology progression, we performed stereotaxic injections targeting the mouse striatum with three fibrilar α-Synuclein types: wt-fibrils, phosphorylated S129 fibrils and, phosphorylation incompetent, S129A fibrils. With all three different fibrilar types injected, we were able to detect cytoplasmic pathological accumulations of phosphorylated α-Synuclein in the SNpc dopaminergic neurons and in cortical layers, resembling Lewy-bodies. These pathological accumulations are formed by progressive recruitment of endogenous a-Synuclein in fibrilar, proteinase-K resistant inclusions. Host expression of soluble α-Synuclein is an absolute prerequisite for the de novo formation of these inclusions, because inoculation of all fibrilar types in α-Synuclein null animals resulted in no pathology.We show, that in wt mice intracerebral injections of phosphorylated fibrils induced a more widespread formation of pathological inclusions and triggered dopaminergic neuronal loss compared to the other two fibrilar types. In agreement with the dopaminergic neuronal loss, significant reductions in the striatal concentrations of dopamine and fine motor symptoms were evident in inoculated animals.Interestingly, exacerbated pathology upon in vivo administration of P-PFF was associated with an altered innate immune response, early post injection. This was reflected by a decreased recruitment of CD45highCD11b+ macrophages from the peripheral lymphoid compartment, along with a significant decreased release of the anti-inflammatory cytokine IL-10 in the striatum. Pro-inflammatory TNF-α levels were significantly increased, both early and later during the course of inclusion formation, in mice injected with phosphorylated fibrils. Importantly, we found that phosphorylated fibrils are more efficiently uptaken by primary cortical neurons and lead to increased seeding and accumulation of the endogenous α-Synuclein.Overall, our data highlight the importance of phosphorylation in α-Synuclein induced pathology. Our experiments suggest that S129 phosphorylation, adds “aggregation” capacity to the α-Synuclein assemblies and accelerates pathology progression.

Η α-συνουκλεΐνη είναι μια μικρή πρωτεΐνη που απαντάται κυρίως στις νευρικές απολήξεις. Βιοχημικές και γενετικές μελέτες έχουν συνδέσει το ρόλο της με την παθολογία της νόσου του Πάρκινσον. Η α-συνουκλεΐνη συσσωρεύεται και εναποτίθεται επιλεκτικά σε πρωτεϊνικά έγκλειστα, σωμάτια και νευρίτες Lewy, που αποτελούν το κύριο παθολογικό χαρακτηριστικό εύρημα στους ασθενείς με νόσο του Πάρκινσον καθώς και σε άλλες συνουκλεϊνοπάθειες. Η παρουσία αδιάλυτων πρωτεϊνικών εγκλείστων α-συνουκλεΐνης στα σωμάτια Lewy, θεωρείται το αποτέλεσμα μια διαδικασίας σταδιακής μετατροπής της μονομερούς α-συνουκλεΐνης σε αρχικά διμερείς και εν συνεχεία ινώδεις αδιάλυτες μορφές. Ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών έχει εστιάσει στην έκκριση και τη διακυτταρική μεταφορά των ινιδίων της α-συνουκλεΐνης, ως πιθανούς μηχανισμούς επαγωγής και διάδοσης της παθολογίας. Ο μηχανισμός που οδηγεί στην προοδευτική συσσώρευση της α-συνουκλεΐνης και το σχηματισμό των αμυλοειδών ινιδίων in vivο, παραμένει αδιευκρίνιστος. Μελέτες έχουν δείξει ότι οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις της α-συνουκλεΐνης και κυρίως η φωσφορυλίωση στη θέση Ser129 παίζουν καθοριστικό ρόλο, επηρεάζοντας τη διαλυτότητα και τον ολιγομερισμό της σε αδιάλυτα συσσωματώματα. Η φωσφορυλίωση της α-συνουκλεΐνης στη θέση S129 αποτελεί την πιο κοινή μετά-μεταφραστική τροποποίηση. Υπολογίζεται ότι το 90% της συνουκλεΐνης, που συσσωρεύεται στα σωμάτια Lewy από ασθενείς με νόσο του Πάρκινσον, είναι φωσφορυλιωμένη στο συγκεκριμένο κατάλοιπο. Παραμένει παρόλα αυτά άγνωστο εάν η παρουσία φωσφορυλιωμένων μορφών έχει κάποιο αιτιολογικό ρόλο στη δημιουργία των εγκλείστων ή πρόκειται για μία δευτερεύουσα επακόλουθη τροποποίηση, καθώς επίσης και ο ρόλος της φωσφορυλίωσης της α-συνουκλεΐνης στην επαγωγή τοξικότητας.Για να μελετηθεί ο ρόλος της φωσφορυλίωσης στην δημιουργία και μετάδοση της παθολογίας in vivo, μύες αγρίου τύπου ενέθηκαν στερεοτακτικά στο ραβδωτό σώμα με τρία διακριτά παρασκευάσματα ανασυνδυασμένων ινιδίων α-συνουκλεΐνης: α) αγρίου τύπου (wt) β) μόνιμα φωσφορυλιωμένα στη θέση Ser129 και γ) ινίδια που φέρουν τη σημειακή μετάλλαξη S129A, με αποτέλεσμα να καταργείται η θέση φωσφορυλίωσης. Τα αποτελέσματα της μελέτης δείχνουν ότι η έγχυση των τριών τύπων ανασυνδυασμένων ινιδίων α-συνουκλεΐνης σε μύες αγρίου τύπου, έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό πρωτεϊνικών εγκλείστων κυρίως στα σώματα των ντοπαμινεργικών νευρώνων της μέλαινας ουσίας και το φλοιό, σε δομές που προσομοιάζουν τα σωμάτια Lewy. Τα πρωτεϊνικά έγκλειστα είναι πλούσια σε φωσφορυλιωμένη α-συνουκλεΐνη, που θεωρείται παθολογική και προκύπτουν ως αποτέλεσμα συσσωμάτωσης της ενδογενούς α-συνουκλεΐνης σε συμπαγείς ινιδιακές δομές, που παραμένουν αδιάλυτες ακόμα και μετά από εκτενή κατεργασία με πρωτεϊνάση Κ. Η έκφραση της ενδογενούς πρωτεΐνης αποτελεί αναγκαία προϋπόθεση για τη διαμόρφωση των παθολογικών εγκλείστων, καθώς αντίστοιχες εγχύσεις σε μύες που στερούνται έκφρασης της ενδογενούς α-συνουκλεΐνης έχουν σαν αποτέλεσμα την πλήρη απουσία παθολογίας. Τα φωσφορυλιωμένα ινίδια επάγουν συνολικά πιο έντονη παθολογία εγκλείστων α-συνουκλεΐνης, που επηρεάζουν σημαντικά τη βιωσιμότητα των ντοπαμινεργικών νευρώνων της μέλαινας ουσίας. Ως συνέπεια, τα επίπεδα της ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα μειώνονται δραστικά επηρεάζοντας τη λεπτή κινητικότητα των μυών. Το διαφορετικό πρότυπο ανοσοαπόκρισης στην αρχική έγχυση των τριών τύπων ινιδίων, συμβάλει καθοριστικά στην εξέλιξη της παθολογίας. Τα φωσφορυλιωμένα ινίδια επάγουν σημαντικά μειωμένη στρατολόγηση μακροφάγων CD45υψηλόCD11b+από την περιφέρεια και εμφανίζουν μειωμένη παραγωγή και έκκριση της αντι-φλεγμονώδους κυτταροκίνης IL-10. Παράλληλα, τα επίπεδα της προ-φλεγμονώδους κυτταροκίνης TNF-α, παραμένουν αυξημένα στους μύες που ενίονται με τα φωσφορυλιωμένα ινίδια. Σε συμφωνία με τα in vivo αποτελέσματα, πρωτογενείς φλοιικοί νευρώνες που επωάζονται με τα φωσφορυλιωμένα ινίδια εμφανίζουν αυξημένη ικανότητα πρόσληψης και κατά συνέπεια, αυξημένη συσσώρευση της ενδογενούς πρωτεΐνης σε παθολογικές μορφές, συγκριτικά με τους δύο άλλους τύπους ινιδίων.Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι η φωσφορυλίωση της α-συνουκλεΐνης στη θέση S129 δρα "συνεργιστικά", ενισχύοντας την τάση των αμυλοεϊδών μορφών να επάγουν τη δημιουργία παθολογικών εγκλείστων και επιταχύνοντας τη διακυτταρική μεταφορά.