Εφαρμογές της γονιδιωματικής και πρωτεωμικής ανάλυσης για τη μελέτη και βιοτεχνολογική αξιοποίηση οινοποιητικών γηγενών στελεχών ζυμομυκήτων

Abstract

Several indigenous yeast strains were isolated from spontaneously fermenting Debina must. All isolates were taxonomically characterized using molecular approaches i.e. sequencing of the variable ITS1 - 5.8S rDNA - ITS2 and D1/D2 regions. Based on these analyses, the isolates from Sample I, exhibiting β-glucosidase activity, were identified as: H. gulliermondii (ΖΥ1, ΖΥ2, ΖΥ3), R. mucilaginosa (ΖΥ5), P. anomala (ΖΥ4) and M. pulcherrima, var. zitsae (ΖΥ6). Regarding the isolates of Sample II, all indigenous strains proved to belong to the species S. cerevisiae. Proceeding with the investigation of the impact of the indigenous yeast on wine characteristics, various isolated strains were used as starter cultures for the production of the local Debina wine. Strain Z622 (S. cerevisiae) served as a starter in year 2005, while in years 2006 and 2007 non-Saccharomyces strains (ZY6 or a mixture of ZY3, ZY4) and Z622 (S. cerevisiae) were used in a sequential fashion. In every purpose, a second tank containing the same must inoculated with a S. cerevisiae commercial starter culture, routinely used by the winery, served as a control vinification. A comparative study of the produced wines concerning their physicochemical features, as well as their profiles of several volatile compounds, revealed that the wine produced with the indigenous strains exhibited the best organoleptic characteristics and the richest aromatic bouquet. With regard to the evaluation of the proteome changes and the identification of those proteins induced in Debina-must fermentation we compared the 2D PAGE maps of strain Z622 cells grown in three different media (YM, MM, Debina must). The 14 intracellular yeast proteins induced only during must fermentation were identified unambiguously by MS analysis, apparently involved in various metabolic pathways such as glycolysis, amino-acid metabolism or production of antioxidants. was selected because as compared to the rest In order to verify the proteomics data, we studied the induction of the bi-functional O-acetylhomoserine sulfhydrylase/ O-acetylserine sulfhydrylase on the transcriptional level employing a reverse transcriptional-PCR analysis. This enzyme is considered the most important for the wine industry due to its involvement in the limitation of reduced sulfides in the wine. This study underlines the variation in pathway regulation under fermentation conditions, implying the importance of a thorough understanding of this complex procedure.

Κατά τη διάρκεια αυθόρμητης οινοποίησης γλεύκους Ντεμπίνα απομονώθηκαν στελέχη ζυμομυκήτων από τη Φάση Ι: αρχή της ζύμωσης και από τη Φάση ΙΙ: τέλος της ζύμωσης. Τα στελέχη που απομονώθηκαν ταυτοποιήθηκαν με βάση τους πολυμορφισμούς της περιοχών ITS1-5.8S rDNA -ITS2 και D1/D2. Από τη Φάση Ι ταυτοποιήθηκαν έξι στελέχη τα οποία εμφάνισαν δραστικότητα β-γλυκοζιδάσης και τα οποία ταξινομήθηκαν ως H. gulliermondii (ΖΥ1, ΖΥ2, ΖΥ3), R. mucilaginosa (ΖΥ5), P. anomala (ΖΥ4) και M. pulcherrima, var. zitsae (ΖΥ6). Από τη Φάση ΙΙ απομονώθηκαν πέντε στελέχη Ζ607, Ζ608, Ζ614, Ζ617 και Ζ622 τα οποία ταξινομήθηκαν ως στελέχη του είδους S. cerevisiae. Με σκοπό τη μελέτη της επίδρασης των γηγενών στελεχών ζυμομυκήτων στον αρωματικό χαρακτήρα οίνων Ντεμπίνα, χρησιμοποιήσαμε τα απομονωθέντα στελέχη ως καλλιέργειες εκκίνησης. Το έτος 2005 χρησιμοποιήθηκε το στέλεχος Ζ622, ενώ τα έτη 2006 και 2007 χρησιμοποιήθηκε μεθοδολογία διαφορικής οινοποίησης με τα στελέχη non-Saccharomyces (ΖΥ6 ή μίγμα ΖΥ3 και ΖΥ4) να λειτουργούν ως καλλιέργειες εκκίνησης και το στέλεχος Ζ622 (S.cerevisiae) να χρησιμεύει ως καλλιέργεια ολοκλήρωσης. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε οινοποίηση του ιδίου γλεύκους με ένα εμπορικό στέλεχος του είδους S.cerevisiae. Η οργανοληπτική και αεριοχρωματογραφική ανάλυση των παραχθέντων οίνων αποκάλυψε ότι οι παραχθέντες οίνοι με τα γηγενή οινοποιητικά στελέχη είχαν καλύτερα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά και πλουσιότερο αρωματικό δυναμικό από τους αντίστοιχους οίνους μάρτυρες, επιβεβαιώνοντας την άποψη ότι τα γηγενή στελέχη ζυμών κάθε αμπελώνα είναι αυτά που προδίδουν στον οίνο τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του. Στοχεύοντας στη διερεύνηση των βιοχημικών πορειών που επάγονται κατά τη ζύμωση γλεύκους, πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια της Ηλεκτροφόρησης δύο διαστάσεων, συγκριτική πρωτεωμική ανάλυση των κυττάρων του στελέχους Ζ622 που ζύμωσαν τρία διαφορετικά θρεπτικά υποστρώματα YΜ, ΜΜ και Γλεύκος. Τα επαγόμενα πρωτεϊνικά μόρια μόνο κατά τη ζύμωση γλεύκους που ταυτοποιήθηκαν με μεθοδολογία LC-MS/MS εμπλέκονται σε διάφορες μεταβολικές πορείες όπως η γλυκόλυση, ο μεταβολισμός αμινοξέων, η παραγωγή αντιοξειδωτικών κ.ά Από τα ανιχνευθέντα ένζυμα το κυριότερο για τις οινοποιητικές βιομηχανίες είναι η σουλφυδρυλάση της Ο-ακετυλο-σερίνης/Ο-ακετυλο-ομοσερίνης, λόγω του ότι η επαγωγή του ή όχι συνδέεται με τη συγκέντρωση του H2S, μιας ουσίας της οποίας η δυσάρεστη οσμή μπορεί να καταστρέψει τον οίνο. Τα αποτελέσματα της πρωτεωμικής ανάλυσης επιβεβαιώθηκαν και στο μεταγραφικό επίπεδο με τη χρήση μεθοδολογίας RT-RCR.