Από το σταφύλι στον οίνο: μοριακή ταυτοποίηση ζυμών και δυναμική εξέλιξη των μικροβιακών κοινοτήτων

Abstract

The ability to assess and quantify the various populations within yeast communities is fundamental towards understanding the development and function of grape/wine ecosystems. Grape berries and juice constitute a dynamic yeast niche influenced by several geochemical constraints and certain biological attributes. Botrytis cinerea is an important grape pathogen that dramatically alters the physicochemical state of berries and consequently may affect the structure of yeast community. Nevertheless, the impact of Botrytis infection on the wine microflora is surprisingly poorly documented. In this study, the yeast flora associated with healthy or Botrytis-infected grapes cultivated in Attica and Arcadia regions and the yeast population dynamics during the alcoholic fermentation of the respective juice samples were assessed. Yeast isolates were identified at the species level by using Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) and sequence analyses of the 5.8S ITS and the D1/D2 ribosomal DNA regions of cultivable yeasts. Community-level profiles were also obtained by direct analysis of fermenting samples through PCR amplification and Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) of 26S rDNA fragments. Structural divergences in yeast communities between samples of different sanitary state or geographical origin were observed. Botrytis infection encouraged a greater population and diversity of yeasts on grape berries, enriched with fermentative or spoilage species such as Metschnikowia pulcherrima and Issatchenkia occidentalis or Zygosaccharomyces bailii. In all cases, Botrytis infection severely perturbed the bioprocess of fermentation by dramatically altering species heterogeneity and succession during the course. At the beginning and the mid of fermentations Botrytis-affected samples possessed higher levels of biodiversity compared to their healthy counterparts, enriched with fermentative and/or spoilage species such as Zygosaccharomyces bailii and Issatchenkia spp. or Kluyveromyces dobzhanskii. Among others, strains belonging to the genus Kazachstania were isolated from Botrytis-affected fermenting grape juice. Phylogenetic analysis showed that the four strains represent a distinct species within the genus Kazachstania in close relation to Kazachstania zonata and Kazachstania gamospora. Electrophoretic karyotyping and physiological analysis supported the affiliation of the four strains to a novel species for which the name Kazachstania hellenica sp. nov. is proposed. Changes introduced by Botrytis invasion influenced final species dominance. Selection was not species-specific and two different populations could be recovered at the end of Botrytis-affected fermentations, i.e. Saccharomyces cerevisiae in samples from Arcadia and Z. bailii in samples from Attica. The governing of wine fermentations by Z. bailii is reported for the first time here and could elucidate the origins and role of this particularly spoilage microbe for the wine industry. This is the first survey to compare between healthy and Botrytis-affected grape and juice samples by using both culture-based and -independent molecular methods, in an attempt to further illuminate the complex yeast ecology of grapes and must fermentations.

Οι ράγες και το γλεύκος των σταφυλιών αποτελούν ένα ιδιαίτερο οικοσύστημα, η δομή του οποίου καθορίζεται από διάφορους γεωχημικούς και βιολογικούς παράγοντες. Ο μύκητας Botrytis cinerea είναι ένα σημαντικός παθογόνος παράγοντας των σταφυλιών που επηρεάζει δραματικά τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά τους. Το ερώτημα που προκύπτει είναι κατά πόσο η αλλαγή στην φυσιολογική κατάσταση των βοτρυωμένων ραγών θα μπορούσε να επηρεάσει και αν ναι με ποιον τρόπο τη δομή της βιοκοινότητας των ζυμών στην επιφάνεια των σταφυλιών και ακολούθως τη δυναμική τους εξέλιξη κατά την διάρκεια της αλκοολικής ζύμωσης. Στην παρούσα μελέτη εξετάστηκαν οι ενδογενείς πληθυσμοί των ζυμών που αποικίζουν την επιφάνεια υγιών και προσβεβλημένων από Βοτρύτη σταφυλιών από αμπελώνες της Αττικής και της Αρκαδίας καθώς και η δυναμική τους εξέλιξη κατά την αλκοολική ζύμωση των αντίστοιχων γλευκών. Η ετερογένεια των ειδών προσδιορίστηκε με ανάλυση πολυμορφισμού μήκους θραυσμάτων περιορισμού (RFLP) σε συνδυασμό με ανάλυση αλληλούχησης των 5.8S ITS και D1/D2 περιοχών του ριβοσωμικού DNA των απομονωθέντων ζυμών. Επιπλέον, πρότυπα της βιοκοινότητας ανακτήθηκαν με άμεση ανάλυση των γλευκών μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης σε συνδυασμό με την βαθμιδωτή αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση πηκτής (PCR-DGGE) χωρίς προηγούμενη καλλιέργεια των ζυμών σε τρυβλία. Δομικές διαφορές παρατηρήθηκαν στις κοινότητες των ζυμών μεταξύ δειγμάτων διαφορετικής φυσιολογικής κατάστασης (υγιή/βοτρυωμένα) ή γεωγραφικής προέλευσης. Η προσβολή από Βοτρύτη ευνόησε την ανάπτυξη υψηλού πληθυσμού ζυμών στην επιφάνεια των ραγών ενώ παράλληλα η ζυμοχλωρίδα εμπλουτίστηκε με νέα ζυμωτικά ή αλλοιωγόνα είδη όπως τα Metschnikowia pulcherrima και lssatchenkia occidentalis ή το Zygosaccharomyces bailii. Σε όλες τις περιπτώσεις, η προσβολή από τον Βοτρύτη διατάραξε σημαντικά και την πορεία της ζύμωσης μεταβάλλοντας δραματικά την ετερογένεια και τη διαδοχή των ζυμών. Κατά τα αρχικά και ενδιάμεσα στάδια των ζυμώσεων τα βοτρυωμένα δείγματα παρουσίαζαν υψηλότερα επίπεδα βιοποικιλότητας σε σχέση με τα αντίστοιχα υγιή. Η βιοκοινότητα των βοτρυωμένων δειγμάτων ήταν εμπλουτισμένη με ζυμωτικά και/ή αλλοιωγόνα είδη όπως τα Kluyveromyces dobzhanskii και lssatchenkia spp. ή το Zygosaccharomyces bailii. Μεταξύ άλλων, στελέχη ζυμών του γένους Kazachstania απομονώθηκαν κατά την διάρκεια αλκοολικών ζυμώσεων γλεύκους από βοτρυωμένα σταφύλια. Η φυλογενετική ανάλυση έδειξε ότι τα στελέχη αυτά αντιπροσωπεύουν ένα ξεχωριστό είδος μέσα στο γένος Kazachstania σε στενή σχέση με τα είδη Kazachstania zonata και Kazachstania gamospora. Η περαιτέρω ανάλυση καρυότυπου και οι μορφολογικοί-φυσιολογικοί χαρακτήρες υποστηρίζουν την κατάταξη των στελεχών σε ένα νέο είδος για το οποίο προτείνεται το όνομα Kazachstania hellenica sp. nov. Τα βοτρυωμένα δείγματα διαφοροποιούνταν από τα αντίστοιχα υγιή και ως προς την τελική επικράτηση είδους. Η επιλογή αυτή δεν ήταν εξειδικευμένη ως προς το είδος καθότι δυο διαφορετικοί πληθυσμοί ανακτήθηκαν από τα τελικά στάδια των ζυμώσεων. Πιο συγκεκριμένα, το Saccharomyces cerevisiae επικράτησε στα δείγματα της Αρκαδίας ενώ το Ζ. bailii στα δείγματα της Αττικής. Η κυριαρχία του Ζ. bailii σε αλκοολικές ζυμώσεις σταφυλιών αναφέρεται εδώ για πρώτη φορά. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται βοηθούν στην αποσαφήνιση της προέλευσης και του ρόλου αυτού του ιδιαιτέρως αλλοιωγόνου μικροοργανισμού στην τεχνολογία παραγωγής οίνου. Η παρούσα εργασία αποτελεί την πρώτη συγκριτική μελέτη μεταξύ υγιών και βοτρυωμένων δειγμάτων με την εφαρμογή έμμεσων και άμεσων μοριακών μεθόδων ταυτοποίησης σε μια προσπάθεια να αποτυπωθεί η σύνθετη χλωρίδα του σχετιζόμενου με τον οίνο οικοσυστήματος.