Η διαλυτή γουανυλική κυκλάση στο ALI / ARDS συνέπεια σήψης

Abstract

Soluble guanylyl cyclase (sGC) is a cGMP generating enzyme implicated in the control of smooth muscle tone that also regulates platelet aggregation. Moreover, sGC activation has been shown to reduce leukocyte adherence to the endothelium. Herein, we investigated the expression of sGC in a murine model of LPS-induced lung injury and evaluated the effects of sGC inhibition in the context of acute lung injury (ALI). Lung tissue sGC α1 and β1 subunits protein levels were determined by western blot and immunohistochemistry, and steady-state mRNA levels for the β1subunit were assessed by real-time PCR. LPS inhalation resulted in a decrease in β1 mRNA levels, as well as a reduction in both sGC subunit protein levels. Decreased α1 and β1 expression was observed in bronchial smooth muscle and epithelial cells. Tumor necrosis factor-α (TNF-α) was required for the LPS-triggered reduction in sGC protein levels, as no change in α1 and β1 levels was observed in TNF-α knockout mice. To determine the effects of sGC blockade in LPS-induced lung injury, mice were exposed to ODQ prior to the LPS challenge. Such pretreatment led to a further increase in total cell number (mainly due to an increase in neutrophils) and protein concentration in the bronchoalveoalar lavage fluid; the effects of ODQ were reversed by a cell-permeable cGMP analogue. We conclude that sGC expression is reduced in LPS-induced lung injury, while inhibition of the enzyme with ODQ worsens lung inflammation, suggesting that sGC exerts a protective role in ALI. Keywords: endotoxin, cGMP, soluble guanylyl cyclase; acute lung injury Abstract Abbreviations: acute lung injury (ALI); bronchoalveolar lavage fluid (BALF); nitric oxide (NO); NO sysnthase (NOS); soluble-guanylyl-cyclase (sGC); lipopolysaccharide (LPS); Tumor Necrosis Factor (TNF) -α; 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one (ODQ); 8pCPTcGMP (8-(4-chlophenylthio)-guanosine 3,5 cyclic monophosphate) dimethyl sulfoxide (DMSO);

Διαλυτή Γουανυλική Κυκλάση (δΓΚ) αποτελεί το ένζυμο για το σχηματισμό του cGMP, και εμπλέκεται στη ρύθμιση του τόνου των λείων μυών και τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων. H ενεργοποίηση της δΓΚ έχει διαπιστωθεί ότι επιδρά αρνητικά στην προσκόλληση των ουδετερόφιλων κυττάρων στο ενδοθήλιο. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήσαμε την έκφραση της δΓΚ σε πειραματικό μοντέλο οξείας πνευμονικής βλάβης, επιμύων που εισέπνευσαν εκνέφωμα ενδοτοξίνης και εκτιμήσαμε την επίδραση της αναστολής της δΓΚ στα πλαίσια του συνδρόμου ALI/ARDS. Χρησιμοποιώντας μεθόδους ανοσοτύπωσης κατά Western και ανοσοιστοχημείας μελέτησαμε τη συγκέντρωση πρωτεΐνης επίπεδα και με real time -PCR υπολογίσαμε τα επίπεδα mRNA των υπομονάδων α1 και β1 της δΓΚ στον πνευμονικό ιστό επιμύων του πειραματικού αυτού μοντέλου. Η εισπνοή ενδοτοξίνης είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του mRNA της β1 υπομονάδας, καθώς και τη μείωση των πρωτεϊνικών επιπέδων αμφότερων των υπομονάδων της δΓΚ. Η μειωμένη έκφραση των α1 και β1 υπομονάδων της δΓΚ παρατηρήθηκε επίσης και με ανοσοϊστοχημική ανάλυση, στα λεία μυικά κύτταρα και τα επιθηλιακά κύτταρα των βρόγχων του πνεύμονα των επιμύων. Επίσης διαπιστώθηκε ότι ο παράγοντας νέκρωσης όγκου (Tumor Necrosis Factor) - α, αποτελεί προυπόθεση για τη μείωση των πρωτεϊνικών επιπέδων της δΓΚ, καθώς δεν παρατηρείται καμία μεταβολή των υπομονάδων α1 και β1 σε διαγονιδιακά ποντίκια με ομόζυγη έλλειψη της κυτταροκίνης μετά την εισπνοή ενδοτοξίνης. Για να εξετάσουμε την επίδραση της αναστολής της ενζυμικής δράσης της δΓΚ, στην πνευμονική βλάβη από την εισπνοή ενδοτοξίνης, τα πειραματόζωα εκτέθηκαν στον ειδικό αναστολέα ODQ, προτού εισπνεύσουν τα εκνέφωμα ενδοτοξίνης. Η χορήγηση εισπνεόμενου ODQ οδήγησε σε περαιτέρω αύξηση του αριθμού των ουδετερόφιλων κυττάρων και της συγκέντρωσης πρωτεΐνης στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, επιτείνοντας τη φλεγμονή στον πνεύμονα, που προκαλείται από την εισπνοή ενδοτοξίνης. Τα αποτελέσματα αυτά ήταν δυνατό να αναστραφούν με τη χορήγηση ειδικού αναλόγου του cGMP. Συμπερασματικά στην παρούσα μελέτη διαπιστώσαμε ότι η έκφραση της δΓΚ μειώνεται στο πειραματικό μοντέλο επιμύων με οξεία πνευμονική βλάβη, μετά από εισπνοή ενδοτοξίνης, ενώ η αναστολή της ενζυμικής δράσης του, επιδεινώνει ακόμη περισσότερο την φλεγμονώδη βλάβη στον πνεύμονα. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ένα προστατευτικό ρόλο της δΓΚ στην οξεία πνευμονική βλάβη στα πλαίσια του συνδρόμου ALI/ARDS. Συντομογραφίες περίληψης : Oξεία πνευμονική βλάβη: acute lung injury (ALI), Βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα: bronchoalveolar lavage fluid (BALF), Μονοξείδιο του αζώτου: (NO), Συνθάση του ΝΟ: (NOS), διαλυτή γουανυλική κυκλάση : (δΓΚ), λιποπολυσακχαρίτης (LPS), Παράγοντας νέκρωσης όγκων-α: Tumor Necrosis Factor (TNF)-α, 1H-[1,2,4]οξαδιοζολο[4,3-a]κινοξαλίνη-1-ένα (ODQ), 8-(4-χλωροφαινύλθιο)- 3,5 κυκλική μονοφωσφορική γουανοσίνη: (8pCPTcGMP), Διμεθυλο σουλφοξίδιο: (DMSO).