Οικολογία και ταυτοποίηση των αλλοιογόνων μικροοργανισμών των ιχθύων Sparus aurata, Boops boops και Oreochromis niloticus

Abstract

Nowadays, the increase of fish production is the result of tensional fishing and the development of aquaculture. In addition, for an efficient fish marketing, the quality assurance is a prerequisite. In this sense, the hygiene, the storage, and the delivery but as well as the concept of fish quality should be amended. Although, previous studies have established differences among the microflora found in temperate fish, only a few reports have studied the microbial associations or diversity of Mediterranean fish (Chapter 1).Therefore the aim of the present report was firstly to evaluate the microflora involved in fish spoilage within the Mediterranean area. Three fish species of economical importance for Greece, Sparus aurata, Boops hoops and Oreochromis niloticus, were chosen to study the development of microbial association under various storage conditions (Chapter 2). A significant effect on the selection of the prevailing microorganisms, depending on the storage, was observed. Particularly, an extended shelf life of fish stored under modified atmosphere packaging was detected. The predominant microflora under those conditions consisted mainly of Grampositive bacteria (Br. thermosphacta, lactic acid bacteria). On the other hand, under aerobiosis, Gram-negative taxa, such as Pseudomonas spp. and Sh. putrefaciens, were the main bacteria. However it should be noted that at 20°C, and under both modified atmosphere and aerobic conditions, Pseudomonas spp., Sh. putrefaciens and enteric bacteria were the prevailing microorganisms.In the third chapter microbial groups (families, genera) as well as specific species relevant to fish spoilage were established. For Pseudomonas and Shewanel/a species, the main taxa involved in fish spoilage, a detailed phenotypic characterization based on physiological traits and SDS-PAGE protein profiles were determined. Based on such techniques, three different biogroups were recognized within Sh. putrefaciens. For fish stored aerobically at 0 and 10°C, Ps lundensis and Ps. fluorescens were recognized before and during the spoilage process as the predominant microflora. Independently of the storage conditions, Proteus vulgar is/mirabilis, Morganella morganii, Providencia spp., Serratia marcescens and Enterobacter spp., were the main Enterobacteriaecea. Carnobacterium piscicola and Lactobacillus plantarum were identified as the main taxa of the lactic acid bacteria, whereas yeasts constituted a minor percentage of the total microflora. Finally, based on physiological characteristics, the Brochothrix thermosphacta isolates were in accordance to the type strain and therefore they constituted a homogeneous taxon.On the fourth and final chapter, the behavior of Pseudomonas spp., Sh. putrefaciens, and Br. thermosphacta was studied, individually or in co-existence, using various food models. The growth rates and the metabolic products of such bacteria were determined. The growth of Pseudomonas spp., was correlated with the glucose and lactate breakdown, the high production of amino acids and the increase of pH. When Sh. putrefaciens was used, formic acid as well as an unknown organic acid were mainly detected. Finally, the samples inoculated with Br. thermosphacta exhibited the most stable pH and concentration of lactate. It should be indicated that, among the bacteria used in this study the Br. thermosphacta, consistently displayed the lowest growth rate and final population. Histamine and putrescine should be used as chemical index of fish quality, in contrast to trimethylamine, which did not observed in fish samples.The current study has provided a deeper inside into the microbial association established during fish spoilage. Furthermore, a link has been created between the main microorganisms involved in such procedure and their behavior in food models.

Η εντατική αλίευση και η ανάπτυξη των υδατοκαλλιεργειών έχει ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη της παραγωγής των ιχθύων. Ως επακόλουθο ζήτημα της εμπορίας τους, τίθεται η διασφάλιση της ποιότητας των προϊόντων αυτών. Για την επίτευξη του σκοπού αυτού, χρειάζεται να βελτιώσουμε τόσο την εφαρμογή των κανόνων υγιεινής, των μεθόδων συντήρησης και διανομής όσο και τη γνώση μας για την ποιότητα των ιχθύων. Είναι γνωστό ότι οι ιχθύες είναι ευαλλοίωτα προϊόντα και η αλλοίωσή τους οφείλεται κατά κύριο λόγο στη δράση της μικροβιακής χλωρίδας που φέρουν. Σε μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί έχουν διαπιστωθεί διαφορές στη σύνθεση της μικροβιακής χλωρίδας των ιχθύων της εύκρατης ζώνης, τόσο για τους ιχθύες που συντηρούνται σε αερόβιες όσο και σε τροποποιημένες ατμόσφαιρες συσκευασίας. Εκτεταμένη μελέτη της σύνθεσης της μικροβιακής χλωρίδας των ιχθύων μεσογειακής προέλευσης, δεν έχει αναφερθεί έως τώρα στη βιβλιογραφία (Κεφάλαιο 1).Για την επίτευξη του σκοπού αυτού μελετήθηκε η σύνθεση και μεταβολή της μικροβιακής χλωρίδας σε τρία διαφορετικά είδη ιχθύων Sparus aurata, Boops boops και Oreochromis niloticus, με οικονομική σημασία για την Ελληνική οικονομία (Κεφάλαιο 2). Η επίδραση των συνθηκών συντήρησης είχε ως αποτέλεσμα τη μεταβολή της σύνθεσης της μικροβιακής χλωρίδας. Ειδικότερα παρατηρήθηκε μεγαλύτερη διάρκεια ζωής για τους ιχθύες που συντηρήθηκαν σε τροποποιημένη ατμόσφαιρα συσκευασίας. Η κυρίαρχη μικροχλωρίδα των ιχθύων αυτών αποτελούνταν κυρίως από τους θετικούς κατά Gram μικροοργανισμούς (Br. thermosphacta, γαλακτικά βακτήρια) ενώ μικρότερη ήταν η συμμετοχή της Sh. putrefaciens. Σε αντίθεση με την αερόβια συντήρηση των ιχθύων όπου οι αρνητικοί κατά Gram μικροοργανισμοί Pseudomonas spp. και Sh. putrefaciens ήταν οι κυρίαρχοι μικροοργανισμοί. Ανεξάρτητα από την αέρια σύνθεση της συσκευασίας σε θερμοκρασία συντήρησης 20 °C, οι Pseudomonas spp., Sh. putrefaciens και τα Enterobacteriaceae, ήταν οι κυρίαρχοι μικροοργανισμοί.Διαφορές παρατηρήθηκαν τόσο στις ομάδες των μικροοργανισμών (οικογένειες, γένη) όσο και στα ιδιαίτερα είδη που σχετίσθηκαν με την αλλοίωση των ιχθύων (Κεφάλαιο 3). Τα Ps lundensis και Ps. fluorescens ήταν τα είδη που απαντήθηκαν περισσότερο μεταξύ του πληθυσμού των Pseudomonas. Τα δύο αυτά είδη συσχετίσθηκαν τόσο με τη σύνθεση της αρχικής όσο και της τελικής μικροβιακής χλωρίδας των ιχθύων που συντηρήθηκαν αερόβια σε θερμοκρασία 0 και 10 °C. Μεταξύ των μικροοργανισμών της Sh. putrefaciens, αναγνωρίσθηκαν τρεις υποομάδες που όμως δεν συσχετίσθηκαν περαιτέρω με τις συνθήκες συντήρησης. Οι υποομάδες αυτές είναι δυνατό να διαχωριστούν με τη μέθοδο της ηλεκτροφόρεσης αλλά και βάση των φαινοτυπικών τους χαρακτηριστικών.Τα Proteus vulgaris/mirabilis, Morgane lia morganii, Providencia spp., Serratia marcescens και Enterobacter spp., ήταν τα είδη των Enterobacteriaceae, ανεξάρτητα από τις συνθήκες συντήρησης. Οι μικροοργανισμοί που χαρακτηρίσθηκαν ως Brochothrix thermosphacta συνέθεσαν μία ομογενή ομάδα που είχε τα τυπικά χαρακτηριστικά του στελέχους αναφοράς. To Carnobacterium piscicola και ο Lactobacillus plantarum, ήταν τα κυριότερα είδη των γαλακτικών βακτηρίων, ενώ οι ζύμες σε όλες τις συνθήκες συντήρησης που εξετάσθηκαν, αποτελούσαν μικρό μέρος της σύνθεσης της μικροβιακής χλωρίδας.Τέλος μελετήθηκε η συμπεριφορά των Pseudomonas spp., Sh. putrefaciens, και Br. thermosphacta σε μόνο και συνδυασμένες καλλιέργειες, σε πρότυπα τρόφιμα (Κεφάλαιο 4). Ο ρυθμός ανάπτυξης και τα μεταβολικά προϊόντα ήταν τα επιμέρους θέματα της μελέτης. Η ανάπτυξη των Pseudomonas spp., συσχετίσθηκε με την μείωση της συγκέντρωσης της γλυκόζης, και του γαλακτικού οξέος, την ανάπτυξη των α-αμινομάδων και την ανάπτυξη της τιμής του pH. Στα δείγματα που ενοφθαλμίστηκαν με τα στελέχη της Sh. putrefaciens, η παραγωγή του μυρμηγκικού οξέος και ενός άγνωστου οργανικού οξέος, ήταν οι σημαντικότερες παρατηρήσεις. Αντίστοιχα, στα δείγματα που ενοφθαλμίστηκαν με τον Br. thermosphacta, η τιμή του pH και η συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος μεταβλήθηκαν λιγότερο από ότι στα άλλα δείγματα. Η ισταμίνη και η πουτρεσκίνη θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες ποιότητας των ιχθύων, ενώ η τριμεθυλαμίνη όχι αφού δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα από τα εξεταζόμενα δείγματα.