Διερεύνηση των in vitro και in vivo αντιφλεγμονωδών και αντι-αιμοπεταλιακών μηχανισμών φυσικού εκχυλίσματος από υπο-προϊόντα οινοποίησης μέσω επίδρασης στο μεταβολισμό και τις δράσεις του PAF

Abstract

Introduction: Oxidative, thrombotic and inflammatory status play an important role in atherothrombosis. Wine contains an abundance of micro-constituents of appropriate quality and quantity, with cardioprotective effects, partly through the inhibition of Platelet Activating Factor (PAF). Winery by-products are sources of wine-like micro-constituents that can be used in food supplementation. The aim of this PhD thesis was the analysis of the chemical composition and the evaluation of the in vitro and in vivo antioxidant, anti-thrombotic and anti-inflammatory actions of a hydroethanolic grape pomace extract from red grape varieties. Methodology: The macronutrient composition of the extract, as well as the phenolic compounds’ and fatty acids’ profiles were determined. The extract’s in vitro antioxidant activities were evaluated through the DPPH free radical scavenging ability, serum oxidation resistance and lipoxygenase inhibition. The in vitro anti-thrombotic actions were evaluated through the inhibition of platelet aggregation induced by PAF, ADP, TRAP, collagen and through the inhibition of P-selectin expression on human platelets’ surface. The anti-platelet actions of the extract were compared with those of similar commercially available supplements. The in vitro anti-inflammatory actions were assessed through the inhibition of lipopolysaccharide-induced secretion of the cytokines TNF-α and IL-1β in peripheral blood mononuclear cells. The in vivo effects of the extract were examined in a randomized, double-blind, crossover, placebo-controlled, postprandial study involving 18 healthy women (11 with BMI<25kg/m2 and 7 with BMI≥25kg/m2). The participants took part in two different interventions in which, along with a standardized meal, they consumed either the capsules containing the grape pomace extract capsules, or the placebo capsules. Blood samples were collected over the next 6 hours, in which, classic biochemical markers were measured and oxidative stress, thrombosis and inflammation were assessed. To evaluate oxidative stress, uric acid (UA), end products of lipid (TBARS) and protein oxidation (protein carbonyls, PC) and antioxidant enzymes’ activity (GPx, SOD) were measured. To investigate the anti-thrombotic actions, the ex vivo platelet aggregation induced by PAF, ADP and collagen was assessed. To investigate inflammation, IL-6 levels were measured and PAF metabolism was assessed, through the biosynthetic enzymes’ activity PAF-phosphocholine-transferase (PAF CPT) and lyso-PAF acetyltransferase (AT) and the degrading enzyme PAF-acetylhydrolase (LpPLA2). Results: The grape pomace extract had a high content of fat (55.2%) and dietary fiber (43.9% of total carbohydrates). The main fatty acids detected were linoleic, palmitic, linolenic and oleic acids, while the main phenolic components were catechin, epicatechin and quercetin. The extract’s constituents, under in vitro conditions, were able to scavenge DPPH free radicals, inhibit serum oxidation, reduce platelets’ sensitivity against PAF, ADP, TRAP and collagen, inhibit P-selectin expression on the platelets’ surface induced by TRAP and inhibit TNF-α expression. The extract’s anti-platelet properties revealed no differences in comparison to the commercial supplements’ actions. Regarding the in vivo actions, at some time points in the postprandial study, the consumption of the extract capsules decreased UA and TBARS levels and SOD activity in normal-weight women, while it increased UA levels and decreased PC levels, platelet sensitivity to PAF and ADP, and LpPLA2 activity in overweight/obese women, compared to the placebo intervention. During the extract intervention, increased postprandial response to SOD and fasting sensitized platelet response to collagen was associated with low PAF CPT activity and high fasting LpPLA2 activity, as well as increased postprandial PAF CPT response. Low fasting TG levels and low postprandial TG response were associated with high fasting lyso PAF AT activity, lower postprandial PAF AT lyso response, and greater postprandial LpPLA2 response. Also, fasting increased platelet sensitivity to PAF and reduced postprandial platelet response to PAF were associated with postprandial desensitized platelets to ADP and less postprandial TG response. Conclusions: The hydroethanolic grape pomace extract combines, in vitro and in vivo, antioxidant, anti-platelet and anti-inflammatory properties and could be used as an active agent for the development of products with cardioprotective properties.

Εισαγωγή: Η οξειδωτική, θρομβωτική και φλεγμονώδης κατάσταση, διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην αθηροθρόμβωση. Το κρασί περιέχει πληθώρα μικροσυστατικών κατάλληλης ποιότητας και ποσότητας, με καρδιοπροστατευτική δράση, εν μέρει μέσω αναστολής του Παράγοντα Ενεργοποίησης Αιμοπεταλίων (PAF). Τα υπο-προϊόντα οινοποίησης αποτελούν πηγή μικροσυστατικών παρόμοιων με αυτά που απαντώνται στο κρασί και μπορούν να χρησιμοποιηθούν στον εμπλουτισμό τροφίμων. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να αναλυθεί η χημική σύσταση και να αξιολογηθούν οι in vitro και in vivo αντιοξειδωτικές, αντι-θρομβωτικές και αντι-φλεγμονώδεις δράσεις, ενός υδρο-αιθανολικού εκχυλίσματος υπο-προϊόντων οινοποίησης από κόκκινες ποικιλίες σταφυλιών. Μεθοδολογία: Προσδιορίστηκε η σύσταση του εκχυλίσματος σε μακροθρεπτικά συστατικά και το προφίλ των φαινολικών συστατικών, καθώς και των λιπαρών οξέων. Οι in vitro αντιοξειδωτικές δράσεις αξιολογήθηκαν μέσω της ικανότητας εκκαθάρισης ελευθέρων ριζών DPPH, αντίστασης στην οξείδωση ορού και αναστολής της λιποξυγονάσης. Οι in vitro αντι-θρομβωτικές δράσεις αξιολογήθηκαν μέσω της αναστολής της συσσώρευσης αιμοπεταλίων έναντι των παραγόντων PAF, ADP, TRAP, κολλαγόνο και μέσω της αναστολής της έκφρασης της P-σελεκτίνης στην επιφάνεια ανθρώπινων αιμοπεταλίων. Οι δράσεις του εκχυλίσματος στη συσσώρευση αιμοπεταλίων συγκρίθηκαν με αυτές παρόμοιων εμπορικά διαθέσιμων σκευασμάτων. Οι in vitro αντι-φλεγμονώδεις δράσεις αξιολογήθηκαν μέσω της αναστολής της επαγόμενης από λιποπολυσακχαρίτη, έκκρισης των κυτταροκινών TNF-α και IL-1β σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος. Οι in vivo δράσεις του εκχυλίσματος εξετάστηκαν σε μια τυχαιοποιημένη, διπλά-τυφλή, διασταυρούμενη, ελεγχόμενη με εικονικό σκεύασμα, μεταγευματική μελέτη, στην οποία συμμετείχαν 18 υγιείς γυναίκες (11 με ΔΜΣ<25kg/m2 και 7 με ΔΜΣ≥25kg/m2). Οι συμμετέχουσες έλαβαν μέρος σε δύο διαφορετικές παρεμβάσεις στις οποίες, παράλληλα με ένα τυποποιημένο γεύμα, κατανάλωσαν είτε τις κάψουλες που περιείχαν εκχύλισμα υπο-προϊόντων οινοποίησης, ή τις κάψουλες του εικονικού σκευάσματος. Συλλέχθηκαν δείγματα αίματος για τις επόμενες 6 ώρες, στα οποία μετρήθηκαν κλασσικοί βιοχημικοί δείκτες και αξιολογήθηκε το οξειδωτικό στρες [ουρικό οξύ (UA), τελικά προϊόντα οξείδωσης λιποειδών (ΤΒΑRS) και πρωτεϊνών (πρωτεϊνικά καρβονύλια-PC), δραστικότητα αντι‐οξειδωτικών ενζύμων (GPx, SOD)], η θρόμβωση (ex vivo συσσωρευτική ικανότητα των αιμοπεταλίων έναντι των συσσωρευτικών παραγόντων PAF, ADP και κολλαγόνο) και η φλεγμονή [IL-6, ο μεταβολισμός του PAF μέσω της δραστικότητας των βιοσυνθετικών ενζύμων PAF‐φωσφοχολίνο‐τρανσφεράση (PAF CPT) και λυσο‐PAF ακετυλοτρανσφεράση (AT) και του αποικοδομητικού ενζύμου PAF‐ακετυλοϋδρολάση (LpPLA2)]. Αποτελέσματα: Το εκχύλισμα υπο-προϊόντων οινοποίησης είχε μεγάλη περιεκτικότητα σε λίπος (55,2%) και διαιτητικές ίνες (43,9% των ολικών υδατανθράκων). Τα κυριότερα λιπαρά οξέα που ανιχνεύθηκαν ήταν το λινελαϊκό, το παλμιτικό, το λινολενικό και το ελαϊκό οξύ, ενώ τα κυριότερα φαινολικά συστατικά ήταν η κατεχίνη, η επικατεχίνη και η κερκετίνη. Τα συστατικά του εκχυλίσματος, σε in vitro συνθήκες, ήταν ικανά να δεσμεύσουν ελεύθερες ρίζες DPPH, να αναστείλουν την οξείδωση ορού, να μειώσουν την ευαισθησία των αιμοπεταλίων έναντι των PAF, ADP, TRAP και κολλαγόνο, να μειώσουν την έκφραση P-σελεκτίνης στην επιφάνεια αιμοπεταλίων που επάγεται από TRAP και να αναστείλουν την έκφραση του TNF-α. Η αντι-αιμοπεταλιακή δράση του εκχυλίσματος δεν παρουσίασε διαφορές με αυτή των εμπορικών σκευασμάτων. Όσον αφορά τις in vivo δράσεις, σε ορισμένα χρονικά σημεία στη μεταγευματική μελέτη, η κατανάλωση του σκευάσματος του εκχυλίσματος, μείωσε τα επίπεδα του UA, των TBARS και τη δραστικότητα της SOD στις γυναίκες φυσιολογικού βάρους, ενώ αύξησε τα επίπεδα του UA και μείωσε τα επίπεδα των PC, την ευαισθησία των αιμοπεταλίων έναντι του PAF και του ADP και τη δραστικότητα της LpPLA2 στις υπέρβαρες/παχύσαρκες γυναίκες, σε σύγκριση με την κατανάλωση του εικονικού σκευάσματος. Στην παρέμβαση του εκχυλίσματος, η αυξημένη μεταγευματική απόκριση στην SOD και η ευαισθητοποιημένη απόκριση των αιμοπεταλίων έναντι του κολλαγόνου στη νηστεία, σχετίστηκε με χαμηλή δραστικότητα PAF CPT και υψηλή δραστικότητα LpPLA2 στη νηστεία, καθώς και με αυξημένη μεταγευματική απόκριση στην PAF CPT. Τα χαμηλά επίπεδα νηστείας TG και η χαμηλή μεταγευματική απόκριση TG, σχετίστηκε με υψηλή δραστικότητα της λυσο PAF AT σε κατάσταση νηστείας, μικρότερη μεταγευματική απόκριση της λυσο PAF AT και μεγαλύτερη μεταγευματική απόκριση LpPLA2. Επίσης, η αυξημένη ευαισθησία των αιμοπεταλίων έναντι του PAF σε νηστεία και η μειωμένη μεταγευματική απόκριση των αιμοπεταλίων έναντι του PAF, σχετίστηκε με απευαισθητοποιημένα αιμοπετάλια έναντι του ADP και μικρότερη αύξηση των TG μεταγευματικά. Συμπεράσματα: Το υδρο-αιθανολικό εκχύλισμα υπο-προϊόντων οινοποίησης συνδυάζει αντιοξειδωτικές, αντι-αιμοπεταλιακές και αντι-φλεγμονώδεις ιδιότητες, σε in vitro και σε in vivo επίπεδο και θα μπορούσε να αποτελέσει δραστικό παράγοντα στη δημιουργία προϊόντων με καρδιοπροστατευτικές ιδιότητες.