Η δράση διαφόρων φλαβονοειδών και άλλων αντιοξειδωτικών φυτικής προέλευσης στην αιμοπεταλιακή συσσώρευση in vitro και ex vivo

Abstract

The aim of the present doctoral thesis was the study of action of the flavonoids quercetin, genistein and apigenin to platelet aggregation, after their activation by adenosine diphosphate (ADP), arachidonate acid and the platelet activating factor (PAF). The platelet reactions where studied in human platelets and in washed rabbit platelets, with both three roots of aggregation open, by an aggregometer. The production of thromboxane Α2 (TXA2) was also studied in the form of its sole product, thromboxane Β2 (ΤΧΒ2). Τhe quantitive determination of TXB2 was defined by using γ-camera and radiolabeled thromboxane antibodies. Finally, it was studied whether the three flavonoids can modulate the presence of fibrinogen receptor GP-IIb-IIIa at the external membrane of human platelets with the use of the proper kit and with flow cytometry. From the present study the results were the following: 1) All three flavonoids used inhibit the platelets aggregation induced by ADP, Arachidonate and PAF. For genistein the sequence of activation is PAF<ADP<arachidonate acid, for apigenin PAF<ADP=arachidonate, while for quercetin PAF<ADP<arachidonate. 2) Both three flavonoids cause dose dependent inhibition of thromboxane Α2 production by the stimulated, of each agonist, human platelets, which is related not only with IC50 of the referred substances but also with the estimated MIC for the corresponding percentage ( 50% and 100%) inhibition of the platelets aggregation. 3) The administration of flavonoids in concentration that causes correspondently 50% and 100% inhibition of platelet aggregation, induces downregulation of the fibrinogen receptors GPIIb-IIIa, that tends to 50% and 100% of their number per platelet.Conclusively, during the flavonoids action, the reduction of TXA2 production act as deceleration or as inhibitor of the platelet’s reactions, and as result the complex of GP IIb-IIIa is dipped in the internal platelet membrane and does not allow the fusion of platelets with the molecules of fibrinogen, and finally among them, so the aggregation and the thrombosis are avoided. If this mechanism can be generalized, the flavonoids can be used pharmaceutical as antiplatelet agents..

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη των δράσεων των φλαβονοειδών κουερσετίνη, γενιστεΐνη και απιγενίνη σε αιμοπετάλια, μετά την ενεργοποίησή τους από τη διφωσφορική αδενοσίνη (ADP), το αραχιδονικό οξύ και τον παράγοντα ενεργοποίησης αιμοπεταλίων (PAF). Οι αιμοπεταλιακές αντιδράσεις μελετήθηκαν σε αιμοπετάλια ανθρώπου και σε πλυμένα αιμοπετάλια κουνελιού, με ανοιχτές και τις τρείς οδούς συσσώρευσης, με τη μέθοδο της συσσωρευομετρίας. Μελετήθηκε επίσης η παραγωγή θρομβοξάνης Α2 (ΤΧΑ2), υπό τη μορφή του σταθερού της αποκλειστικού παραγώγου, της θρομβοξάνης Β2 (ΤΧΒ2). Ο προσδιορισμός της ΤΧΒ2 έγινε ποσοτικά με την χρήση γ-κάμερας και ραδιοσημανσθέντων αντισωμάτων της θρομβοξάνης. Τέλος, μελετήθηκε το κατά πόσον οι τρείς ενώσεις ήταν σε θέση να μεταβάλλουν την παρουσία του υποδοχέα ινωδογόνου GP-IIb-IIIa επί της εξωτερικής μεμβράνης των αιμοπεταλίων του ανθρώπου με το κατάλληλο kit και με κυτταρομετρία ροής.Από την παρούσα μελέτη εξήχθησαν τα ακόλουθα δεδομένα: 1)Και τα τρία φλαβονοειδή αναστέλλουν την αιμοπεταλιακή συσσώρευση και από τις τρείς οδούς συσσώρευσης. Για την γενιστεΐνη η σειρά δραστικότητας είναι PAF<ADP<αραχιδονικό οξύ, για την απιγενίνη PAF<ADP=Aραχιδονικό οξύ, ενώ για την κουερσετίνη PAF<ADΡ<αραχιδονικό οξύ. 2)Και τα τρία φλαβονοειδή επιφέρουν δοσοεξαρτώμενη αναστολή της παραγωγής της θρομβοξάνης Α2, από τα διεγερθέντα με τον εκάστοτε αγωνιστή, αιμοπετάλια του ανθρώπου, η οποία σχετίζεται τόσο με τις IC50 των εν λόγω ουσιών όσο και με τις ευρεθείσες MIC για την αντίστοιχου μεγέθους (50% και 100%) αναστολή της αιμοπεταλιακής συσσώρευσης. 3)Η χορήγηση των φλαβονοειδών σε συγκεντρώσεις που προκαλούν αντιστοίχως 50% και 100% αναστολή της αιμοπεταλιακής συσσώρευσης, προκαλούν απόσυρση ή κάλυψη των υποδοχέων ινωδογόνου GPIIb-IIIa, που τείνει προς το 50% και το 100% του αριθμού τους ανά αιμοπεταλιακό κύτταρο.Συμπερασματικά, κατά την δράση των φλαβονοειδών, η μείωση της παραγωγής της ΤΧΑ2 λειτουργεί ως επιβραδυντής ή και πλήρης αναστολέας της ροής των αντιδράσεων των αιμοπεταλίων, με αποτέλεσμα το σύμπλεγμα GP IIb-IIIa να καταβυθίζεται στο εσωτερικό της αιμοπεταλιακής μεμβράνης και να μην επιτρέπεται η συγκόλληση των αιμοπεταλίων με τα μόρια του ινωδογόνου, και τελικά μεταξύ τους, οπότε έχουμε την αποφυγή της συσσώρευσης και του σχηματισμού θρόμβου. Αν ο μηχανισμός αυτός είναι γενικεύσιμος τότε τα φλαβονοειδή μπορούν χρησιμοποιηθούν φαρμακευτικά ως αντιαιμοπεταλιακοί παράγοντες.