3-διάστατη απεικόνιση ιστολογικών δεδομένων στην οπτική μικροσκοπία διερχομένου φωτός

Abstract

Optical microscopy, also known as light microscopy, is a versatile and widely used technique for imaging and studying objects at the microscale and nanoscale level using visible light and optical lenses. It is a fundamental tool in various scientific fields such as biology, materials science, chemistry and medicine. In particular, bright-field microscopy, a fundamental technique in the field of optical microscopy, is one of the simplest and most common methods for observing biological and other transparent samples. However, there is deficiency of comprehensive 3D histological data acquisition and analysis techniques using conventional optical microscopy of transmitted light. Existing methodologies predominantly offer 2D snapshots of tissue sections, overlooking the intricate 3D microarchitecture that plays a vital role in understanding tissue function, development, and disease progression. Three-dimensional imaging is possible using specιαlized microscopes which are usually quite expensive. The question arises as to whether 3D imaging of a tissue is feasible using a conventional optical microscope of transmitted light. In this thesis, we first describe the basic principles of microscopy and common laboratory techniques in histopathology. Then, two techniques for three-dimensional tissue reconstruction from bright-field microscopy images are presented. The first technique involves automating a series of steps to create a digital 3D volume of a tissue from conventional bright-field microscope images. Specifically, digital images of region of interest (defined by an expert) are collected from successive tissue sections. Image registration and deep learning-based interpolation techniques are then used to generate a 3D volume of the region of interest. An expert histopathologist evaluated the information provided by the 3D volume and the results showed that the 3D volume may reveal details that are not clearly visible or even undetectable in the images of a conventional microscope. Unlike other 3D tissue imaging technologies, this technique has the following advantages. (b) It does not require a special device; it can be applied with any conventional bright-field microscope. (c) It can be used for any given routine application, not only for certain specialized clinical studies. The second technique involves the tomographic imaging of a tissue section with optical sectioning (as opposed to the previous technique which involves physical sectioning of the tissue under examination). This technique is based on the idea that each tissue section has a finite thickness and therefore it is possible to create images in different planes (optical slicing) within the tissue section, revealing details that would probably not be seen otherwise. Optical slicing was made possible by the development of a special device (using a stepper motor and Arduino) and software, which allow rotation of the slide containing the tissue section under consideration around the horizontal axis and image acquisition at each position. This rotation converts the optical microscope into a CT geometry with limited number of angles. In this way, tomographic reconstruction algorithms from projections can be used to visually slice the tissue section. Two classical reconstruction algorithms (the filtered back-projection and the algebraic reconstruction technique) were tested. The resulting images were of satisfactory quality, but exhibited some artefacts. In conclusion, the use of classical tomographic reconstruction algorithms with a limited number of projections allows to explore the sample in any desired optical plane, revealing information that would be difficult to detect when focusing only on conventional two-dimensional microscope images.

Η οπτική μικροσκοπία, γνωστή και ως μικροσκοπία φωτός, είναι μία ευέλικτη και ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική για την απεικόνιση και τη μελέτη αντικειμένων σε επίπεδο μικροκλίμακας και νανοκλίμακας με τη χρήση ορατού φωτός και οπτικών φακών. Αποτελεί θεμελιώδες εργαλείο σε διάφορα επιστημονικά πεδία, όπως η βιολογία, η επιστήμη των υλικών, η χημεία και η ιατρική. Ειδικά η μικροσκοπία φωτεινού πεδίου, μία θεμελιώδης τεχνική στον τομέα της οπτικής μικροσκοπίας, είναι μια από τις απλούστερες και πιο κοινές μεθόδους για την παρατήρηση βιολογικών και άλλων διαφανών δειγμάτων. Όμως υπάρχει έλλειψη ολοκληρωμένων τεχνικών λήψης και ανάλυσης τρισδιάστατων ιστολογικών δεδομένων με τη χρήση συμβατικής οπτικής μικροσκοπίας διερχόμενου φωτός. Οι υπάρχουσες τεχνικές προσφέρουν κυρίως δισδιάστατα στιγμιότυπα τομών ιστών, παραβλέποντας την περίπλοκη τρισδιάστατη μικροαρχιτεκτονική που παίζει ζωτικό ρόλο στην κατανόηση της λειτουργίας των ιστών, της ανάπτυξης και της εξέλιξης των ασθενειών. Η τρισδιάστατη απεικόνιση είναι εφικτή με χρήση ειδικών μικροσκοπίων τα οποία συνήθως είναι αρκετά ακριβά. Συνεπώς, το ερώτημα που τίθεται είναι κατά πόσο είναι εφικτή η τρισδιάστατη απεικόνιση ενός ιστού με χρήση ενός συμβατικού οπτικού μικροσκοπίου διερχόμενου φωτός. Στην παρούσα διατριβή, αρχικά περιγράφονται οι βασικές αρχές μικροσκοπίας και οι συνήθεις εργαστηριακές τεχνικές στην ιστοπαθολογία. Στη συνέχεια, παρουσιάζονται δύο τεχνικές για την τρισδιάστατη αναπαράσταση ιστών από εικόνες μικροσκοπίας φωτεινού πεδίου. Η πρώτη τεχνική αφορά στην αυτοματοποίηση μιας σειράς βημάτων για τη δημιουργία ψηφιακού τρισδιάστατου όγκου ενός ιστού από εικόνες συμβατικού μικροσκοπίου φωτεινού πεδίου. Συγκεκριμένα, συλλέγονται ψηφιακές εικόνες περιοχής ενδιαφέροντος (ορισμένη από ειδικό) από διαδοχικές τομές ιστού. Στη συνέχεια, χρησιμοποιούνται τεχνικές ευθυγράμμισης εικόνων και παρεμβολής βασισμένης στη βαθιά μάθηση για τη δημιουργία ενός τρισδιάστατου όγκου της περιοχής ενδιαφέροντος. Ειδικός ιστοπαθολόγος αξιολόγησε την πληροφορία που παρέχεται από τον τρισδιάστατο όγκο και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο τρισδιάστατος όγκος ενδέχεται να αποκαλύπτει λεπτομέρειες που δεν είναι σαφώς ορατές ή ακόμη και μη ανιχνεύσιμες στις εικόνες ενός συμβατικού μικροσκοπίου. Σε αντίθεση με άλλες τεχνολογίες τρισδιάστατης απεικόνισης ιστών, η εν λόγω τεχνική έχει τα εξής πλεονεκτήματα: (α) δεν εξαρτάται από την απόσταση του δείγματος από τους αντικειμενικούς φακούς, παράγοντας τρισδιάστατους όγκους ιστών σε οποιαδήποτε επιθυμητή μεγέθυνση. (β) Δεν απαιτεί ειδικό όργανο, μπορεί να εφαρμοστεί με οποιοδήποτε συμβατικό μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου. (γ) Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για οποιαδήποτε δεδομένη εφαρμογή ρουτίνας, όχι μόνο για ορισμένες εξειδικευμένες κλινικές μελέτες. Η δεύτερη τεχνική αφορά στην τομογραφική απεικόνιση μίας τομής ιστού με οπτικό τεμαχισμό (σε αντίθεση με την προηγούμενη τεχνική που αφορά σε φυσικό τεμαχισμό του υπό εξέταση ιστού). Αυτή η τεχνική βασίζεται στην ιδέα ότι κάθε τομή ιστού έχει πεπερασμένο πάχος και, επομένως, είναι δυνατή η δημιουργία εικόνων σε διαφορετικά επίπεδα (οπτικός τεμαχισμός) εντός της τομής του ιστού, αποκαλύπτοντας λεπτομέρειες που πιθανώς δεν θα φαίνονταν διαφορετικά. Ο οπτικός τεμαχισμός κατέστη εφικτός με την ανάπτυξη μιας ειδικής διάταξης (με χρήση βηματικού κινητήρα και Arduino) και λογισμικού, που επιτρέπουν την περιστροφή του πλακιδίου με την υπό εξέταση τομή γύρω από τον οριζόντιο άξονα και τη λήψη εικόνας σε κάθε θέση. Η περιστροφή αυτή μετατρέπει το οπτικό μικροσκόπιο σε γεωμετρία αξονικής τομογραφίας περιορισμένου αριθμού προβολών. Με τον τρόπο αυτό, μπορεί να γίνει χρήση αλγορίθμων τομογραφικής ανακατασκευής από προβολές για τον οπτικό τεμαχισμό της τομής ιστού. Δοκιμάστηκαν δύο κλασικοί αλγόριθμοι ανακατασκευής (η φιλτραρισμένη οπισθοπροβολή και η αλγεβρική τεχνική ανακατασκευής). Οι εικόνες που προέκυψαν ήταν ικανοποιητικής ποιότητας, αλλά παρουσίαζαν ορισμένα τεχνικά σφάλματα. Συμπερασματικά, η χρήση κλασικών αλγορίθμων τομογραφικής ανακατασκευής με περιορισμένες αριθμό προβολών, επιτρέπει τη διερεύνηση του δείγματος σε οποιοδήποτε επιθυμητό οπτικό επίπεδο, αποκαλύπτοντας πληροφορίες που θα ήταν δύσκολο να εντοπιστούν όταν εστιάζουμε μόνο στις συμβατικές δισδιάστατες εικόνες μικροσκοπίου.