Πρεβιοτική, ανοσορυθμιστική και αντικαρκινική δράση των β-γλυκανών βασιδιομυκήτων του ελλαδικού χώρου: μια μηχανιστική μελέτη

Abstract

Introduction: The intestinal microbiota (Gut Microbiota: GM) refers to the diverse set of microorganisms that colonize the intestinal tract and has a direct interaction with the host’s health. The maintenance and the improvement - in cases of dysbiosis - of its composition constitute the target of various therapeutic regimens. In this scope, one of the approaches currently followed is the consumption of prebiotics. Prebiotics are dietary fibers with beneficial properties for human health, as they reach the large intestine undigested and are selectively fermented by the GM, resulting in the increase of its symbiotic microorganisms’ populations. Key derivatives of the bacterial fermentation of prebiotics are short-chain fatty acids (SCFAs), which have been recognized as key mediators in the regulation of metabolism and immunity. Numerous compounds are currently being examined as potential prebiotics, among which β-glucans, abundant fungal polysaccharides with immunoregulatory, anticancer, antioxidant, antimicrobial and radioprotective effects. Species of the genus Pleurotus are a dietary source of β-glucans and are among the mushrooms that have been widely used for centuries as medicinal means of traditional medicine with various positive effects on the human body. Methods: The aim of the present PhD thesis is to evaluate the beneficial properties of the β-glucan-rich basidiomycete Pleurotus eryngii in terms of prebiotic, immunoregulatory and anti-cancer activities and to investigate the mechanisms that characterize them. The experimental part started with the 24-hour in vitro fermentation of P. eryngii lyophilized powder and its digested and extracted form, by the fecal inoculum of healthy older adults >65 yrs. The potential prebiotic effect of mushrooms on the composition of the volunteers' GM was determined by next generation sequencing (NGS) and the concentration of the produced short-chain fatty acids (SCFAs) was assessed through gas chromatography. Subsequently, human cells (PBMCs: peripheral blood mononuclear cells) and cell lines were exposed to aqueous supernatants of the fermentation and cytokines’ production in macrophages was determined by ELISA at the protein level and real-time qPCR at transcription level. Additionally, the effect of these supernatants on immune cell populations in the peripheral blood was studied by Cytometry by Time of Flight (CyTOF) while the potential cytotoxic and/or genoprotective effect against known genotoxic agents was also investigated. Finally, the potential prebiotic effect of P. eryngii on murine GM was studied in vivo, following consumption of different concentrations of lyophilized mushroom powder by the animals. Results: Metataxonomic and metabolomic analysis results supported the prebiotic properties of P. eryngii due to the recorded as beneficial changes in GM, accompanied by increased production of bioactive SCFAs. The presence of the mushroom in the in vitro fermentation products conferred genoprotective properties against the genotoxic agent t-BOOH, as well as immunoregulatory properties indicated by changes in gene expression and secretion levels of pro- (TNF-α, IL-1β) and anti-inflammatory of cytokines (IL-10, IL-1Ra) in human macrophages but also by the immunophenotypic changes in Th2 and myeloid cells in PBMCs of healthy elderly volunteers. Conclusion: All of the above suggest the contribution of this mushroom’s consumption in health promotion, especially for older individuals, and highlight the prospect of its use in the production of functional foods as a means of prevention and/or treatment of various GI-related diseases.

Εισαγωγή: Ο όρος εντερικός μικροβιόκοσμος (ΕΜ) αναφέρεται στο ποικιλόμορφο σύνολο μικροοργανισμών που εποικίζουν τον εντερικό σωλήνα. Έχει άμεση αλληλεπίδραση με την υγεία του ξενιστή του και η διατήρηση και, σε περιπτώσεις δυσβίωσης, η βελτίωση της σύστασής του αποτελούν στόχο για διάφορα θεραπευτικά σχήματα. Για να επιτευχθεί αυτό, μια από τις προσεγγίσεις που ακολουθούνται πλέον είναι η κατανάλωση πρεβιοτικών. Τα πρεβιοτικά είναι διαιτητικές ίνες με ευεργετικές για την υγεία του ανθρώπου ιδιότητες, καθώς φτάνουν άπεπτες στο παχύ έντερο, εκεί ζυμώνονται επιλεκτικά από τον ΕΜ με αποτέλεσμα την αύξηση των πληθυσμών των συμβιωτικών μικροοργανισμών του. Βασικά παράγωγα της βακτηριακής ζύμωσης των πρεβιοτικών είναι τα λιπαρά οξέα βραχείας αλύσου (Short Chain Fatty Acids: SCFAs), τα οποία έχουν αναγνωριστεί ως βασικοί μεσολαβητές στη ρύθμιση του μεταβολισμού και του ανοσοποιητικού συστήματος. Αρκετές ενώσεις, κυρίως φυσικής προέλευσης, εξετάζονται σήμερα ως πιθανά πρεβιοτικά, μεταξύ των οποίων οι β-γλυκάνες και δη οι μυκητιακές, πολυσακχαρίτες του κυτταρικού τοιχώματος μυκήτων και ζυμών με ανοσορυθμιστική, αντικαρκινική, αντιοξειδωτική, αντιμικροβιακή αλλά και ακτινοπροστατευτική δράση. Τα μέλη του γένους Pleurotus είναι από τα μανιτάρια που έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως ανά τους αιώνες ως φαρμακευτικά μέσα της παραδοσιακής ιατρικής με ποικίλα θετικά για τον ανθρώπινο οργανισμό αποτελέσματα και αποτελούν σημαντική διατροφική πηγή β-γλυκανών. Μεθοδολογία: Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η αξιολόγηση των ευεργετικών ιδιοτήτων σε επίπεδο πρεβιοτικής, ανοσορυθμιστικής και αντικαρκινικής δράσης που διαθέτουν τα πλούσια σε β-γλυκάνες μανιτάρια του βασιδιομύκητα Pleurotus eryngii και η διερεύνηση των μηχανισμών που τις χαρακτηρίζουν. Για το σκοπό αυτό, αρχικά πραγματοποιήθηκε in vitro ζύμωση σκόνης P. eryngii σε τρεις μορφές επεξεργασίας του (μανιτάρι σε μορφή σκόνης, μανιτάρι μετά από προσομοίωση πέψης και εκχύλισμα β-γλυκανών από το μανιτάρι) από εμβόλιο κοπράνων υγιών εθελοντών ηλικίας >65 ετών για 24 ώρες. Κατά τη ζύμωση προσδιορίστηκε η πιθανή πρεβιοτική δράση των μανιταριών στη σύσταση του ΕΜ των εθελοντών με αλληλούχηση νέας γενιάς (NGS) και η συγκέντρωση των παραχθέντων λιπαρών οξέων βραχείας αλύσου (SCFAs) με αέρια χρωματογραφία. Ακολούθως, ανθρώπινα κύτταρα (μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος) και κυτταρικές σειρές εκτέθηκαν σε υδατικά υπερκείμενα της in vitro ζύμωσης και διερευνήθηκε η έκφραση κυτταροκινών σε επίπεδο πρωτεΐνης με ELISA και σε γονιδιακό επίπεδο με real-time qPCR σε μακροφάγα, καθώς και η επίδραση στους πληθυσμούς ανοσοκυττάρων στο περιφερικό αίμα με CyTOF. Επιπλέον, μελετήθηκε η πιθανή κυτταροτοξική ή/και γονοπροστατευτική δράση των υπερκειμένων αυτών στα κύτταρα έναντι γνωστών γονοτοξικών παραγόντων. Τέλος, μελετήθηκε η πιθανή πρεβιοτική δράση του P. eryngii στον EM μυών in vivo, κατόπιν κατανάλωσης διαφορετικών συγκεντρώσεων λυοφιλιωμένης σκόνης του μανιταριού από τα ζώα. Αποτελέσματα: Τα αποτελέσματα της μεταταξινομικής και μεταβολομικής ανάλυσης υποστηρίζουν τις πρεβιοτικές ιδιότητες του P. eryngii, αφού παρατηρήθηκαν ωφέλιμες για την υγεία του ξενιστή μεταβολές στη σύσταση του ΕΜ, που συνοδεύθηκαν από αύξηση της παραγωγής των βιοδραστικών SCFAs. Η in vitro ζύμωση του μανιταριού από εμβόλιο κοπράνων υγιών ηλικιωμένων εθελοντών προσέδωσε στα υπερκείμενα ζύμωσης γονοπροστατευτικές και ανοσορυθμιστικές ιδιότητες, όπως υποδεικνύεται από τις μεταβολές στη γονιδιακή έκφραση και τα επίπεδα έκκρισης των προ- (TNF-α, IL-1β) και αντιφλεγμονωδών κυτταροκινών (IL-10, IL-1Ra) σε ανθρώπινα μακροφάγα αλλά και από τις ανοσοφαινοτυπικές αλλαγές στα T βοηθητικά (helper) 2 (Th2) και μυελοειδή κύτταρα των μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος (PBMCs) υγιών ηλικιωμένων εθελοντών. Συμπεράσματα: Όλα τα παραπάνω παρέχουν σαφή στοιχεία που υποστηρίζουν τη συμβολή του μανιταριού αυτού στην προαγωγή της υγείας των ατόμων που το καταναλώνουν, ιδιαιτέρως αν είναι μεγαλύτερης ηλικίας, και αναδεικνύουν την προοπτική της χρήσης του στην παραγωγή λειτουργικών τροφίμων ως μέσο πρόληψης ή/και θεραπείας πληθώρας νοσημάτων.