Black Aspergilli on grapes: influence of agronomic practices on carposphere microbiome, mycotoxin contamination risk and fungicide resistance

Abstract

Aspergillus bunch rot, caused by several mycotoxigenic species of Aspergillus section Nigri (black aspergilli), is one of the most severe pre- as well as post-harvest diseases of grapevines, while contaminated grape products and derivatives with Aspergillus mycotoxins may have an important impact on consumers health. Going through the new transitioning era of the "European Green Deal", the search for alternative, non-chemical, disease control methods is essential. In the past decades, numerous studies have investigated several factors of Aspergillus bunch rot disease, such as the epidemiology, ecology, diversity, molecular and mycotoxigenic characterization of the disease’s causal agents. Still, there is a lack of knowledge about the impact of cultivation systems (conventional and organic) on disease development. To date, this study demonstrates a holistic approach investigating the impact of farming systems on the: i) population structure of black aspergilli species, ii) mycotoxigenic capacity of black aspergilli originating from each farming system, iii) mycotoxin contamination levels of commercial organically- and conventionally- produced wines, iv) sensitivity levels of black aspergilli species to SDHI, QoI, DMI and phenylpyrroles fungicides, and v) the effect of several viticultural practices on black aspergilli incidence and grape’s carposphere microbiome. The influence of conventional and organic farming systems on black aspergilli population structure in Greek vineyards was thoroughly studied over a two-year survey. A total of 300 Aspergillus spp. isolates were molecularly identified by Sanger amplicon sequencing. Aspergillus species (A. tubingensis, A. uvarum, A. carbonarius, and A. niger) were identified as the disease's causal agents. In the 2018 and 2019 samplings, A. uvarum and A. tubingensis were identified as the prevalent species. Higher rates of A. tubingensis and A. uvarum were discovered in the organic and conventional vineyards during both sample years, respectively. The in vitro production of ochratoxin A and fumonisin B2, B3, and B4 was examined in two selective media, and revealed the presence of a limited number of mycotoxigenic isolates, mostly from conventional vineyards. Furthermore, A. carbonarius was identified as the primary source of OTA, whereas A. niger was the main producer of FBs. A total of 74 organically- and conventionally-produced wines were examined by a new QTOF- MS-MS analytical method developed to identify and quantify different mycotoxins (OTA, FB1, FB2, FB3, AOH, AME, CIT), using a modified QuEChERS extraction methodology. Interestingly, a low frequency of mycotoxin-contaminated wines was detected, whereas FBs were identified as the main mycotoxin contaminants in Greek wines compared to OTA, which was found in only one sample. According to our previous results, we have found that the farming system influenced the population structure of Aspergillus section Nigri species in Greek vineyards. Thus, we tested the hypothesis that the differences in the population structure may be associated with the selection of fungicide-resistant strains within the black aspergilli populations. To address this hypothesis, we determined the sensitivity levels of several A. uvarum, A. tubingensis, A. niger, and A. carbonarious isolates, obtained from both farming systems, to the fungicides fluxapyroxad-SDHIs, pyraclostrobin-QoIs, tebuconazole-DMIs, and fludioxonil- phenylpyrroles. Results revealed a widespread occurrence of resistance to all four (4) fungicides tested in the A. uvarum subpopulation originating mainly from conventional vineyards. On the contrary, A. tubingensis isolates were sensitive to pyraclostrobin, while moderate frequencies of low resistance isolates were identified for tebuconazole, fludioxonil, and fluxapyroxad. Sequencing analysis of the corresponding fungicide target encoding genes revealed the presence of H270Y, H65Q/S66P, and G143A mutations in the sdhB, sdhD, and cytb genes of A. uvarum resistant isolates, respectively. However, no mutations in the CYP51A and CYP51B genes were detected in either A. uvarum or A. tubingensis isolates. These results support the initial hypothesis for the contribution of fungicide resistance in the Aspergillus spp. population structure between the two farming systems, while, this is the first report of A. uvarum resistance to SDHIs and QoIs, represents the first documentation of H270Y, H65Q/S66P, and G143A mutations in sdhB, sdhD, and cytb genes of this fungal species. On the last chapter of this thesis, the impact of defoliation, bunch compactness, and irrigation on Aspergillus frequency, grape berries composition (TA, pH, and TSS), and carpospheres’s microbiome structure at three developmental stages of grapevine (pea size berry, veraison, and harvest), was investigated. The frequency of the Aspergillus species was significantly higher at the harvest stage, with considerable variation among the treatments. Aspergillus was detected in higher frequencies at the irrigated (IR), non-defoliated (NDF), and high bunch density (HBD) treatments compared to the respective mock pairs. Amplicon sequencing analysis of carposphere’s bacterial and fungal communities revealed significant variation among the three (3) growing stages and the performed treatments, while considerable changes were noted in the intragroup diversity (α-diversity) and community analysis (b-diversity) at the stage of harvest. In NIR, LBD, and DF treatments, in which Aspegillus was found in lower frequencies, network analysis revealed negative co-occurrence patterns between Aspergillus and several bacterial genera (Streptococcus, Rhodococcus, Melitangium, Roseomnonas, and Belnapia) reported to have antifungal properties suggesting potential natural attenuation mechanisms for the control of Aspergillus.

H ασθένεια της σήψης των βότρεων (ΑΣΒ) από τα είδη του γένους Aspergillus, θεωρείται μία από τις σημαντικότερες προ- και μετά-συλλεκτικές ασθένειες των σταφυλιών. Η ασθένεια προκαλείται από διάφορα είδη του γένους Aspergillus άθροισμα Nigri (μαύροι ασπέργιλλοι), ενώ η σπουδαιότητα της, έγκειται στις σοβαρές ποσοτικές αλλά και ποιοτικές απώλειες, εξαιτίας της επιμόλυνσης των σταφυλιών και των προϊόντων-σταφυλής με τις μυκοτοξίνες του μύκητα. Διανύοντας τη νέα μεταβατική περίοδο της Ευρωπαϊκής πράσινης συμφωνίας, η διερεύνηση εναλλακτικών, βιολογικών, μη χημικών μεθόδων αντιμετώπισης των ασθενειών, κρίνεται αναγκαία. Μέχρι και σήμερα, το μεγαλύτερο μέρος τής έρευνας που αφορούσε στην ΑΣΒ από είδη μαύρων ασπέργιλλων, επικεντρωνόταν στην επιδημιολογία, οικολογία, παραλλακτικότητα και τον μοριακό και μυκοτοξικογόνο χαρακτηρισμό των μυκήτων που προκαλούν την ασθένεια. Παρόλα αυτά, δεν είναι γνωστή η επίδραση του συστήματος καλλιέργειας (συμβατική και βιολογική καλλιέργεια) στην ανάπτυξη της ασθένειας. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής μελετήθηκε η επίδραση του συστήματος καλλιέργειας: α) στη πλυθησμιακή δομή των μαύρων ασπεργίλλων, ii) στο μυκοτοξικογόνο χαρακτηρισμών των απομονώσεων του μύκητα που προέρχονται από τα δύο συστήματα καλλιέργειας, iii) στο επίπεδο επιμόλυνσης εμπορικών κρασιών συμβατική και βιολογικής καλλιέργειας με μυκοτοξίνες του μύκητα, iv) στα επίπεδα ευαισθησίας των απομονώσεων των μαύρων ασπέργιλλων σε μυκητοκτόνα των ομάδων SDHI, QoI, DMI και στα φαινυλοπυρόλια, και v) στη μελέτη της επίδρασης διαφόρων αμπελουργικών καλλιεργητικών πρακτικών στην συχνότητα εμφάνισης των μαύρων ασπεργίλλων και στη σύσταση του μικροβιώματος της καρπόσφαιρας. Κατά τη διάρκεια διετούς έρευνας που πραγματοποιήθηκε, ελέγχθηκε η επίδραση του συστήματος καλλιέργειας στην πληθυσμιακή δομή των μαύρων ασπεργίλλων. Συνολικά, 300 απομονώσεις του μύκητα συλλέχθηκαν και ταυτοποιήθηκαν μοριακά με αλληλούχιση κατά Sanger. Συνολικά, ταυτοποιήθηκαν τέσσερα κυρίαρχα είδη του μύκητα Aspergillus άθροισμα Nigri (A. tubingensis, A. uvarum, A. carbonarius και A. niger). Τα είδη A. uvarum και το A. tubingensis ταυτοποιήθηκαν ως κυρίαρχα είδη και για τα δύο έτη δειγματοληψιών, ενώ τα είδη A. tubingensis και A. uvarum ανιχνεύθηκαν σε υψηλότερες συχνότητες στους βιολογικούς και συμβατικούς αμπελώνες, αντίστοιχα. Ο in vitro μυκοτοξικογόνος χαρακτηρισμός αποκάλυψε χαμηλή συχνότητα μυκοτοξινογόνων απομονώσεων, που προέρχονταν κυρίως από συμβατικούς αμπελώνες. Επιπλέον, ο μύκητας A. carbonarius αναδείχθηκε ως η κύρια πηγή ΟΤΑ, ενώ το είδος A. niger ευθύνεται κυρίως για την παραγωγή FBs. Επιπλέον, 74 εμπορικά κρασιά βιολογικής και συμβατικής παραγωγής ελέγχθηκαν για την παρουσία διαφόρων μυκοτοξινών (OTA, FB1, FB2 FB3, AOH, AME, και CIT), με μία νέα αναλυτική μεθοδο (Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometer) ταυτόχρονης ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης διάφορων μυκοτοξινών που παράγονται από τα είδη του μύκητα. Η συχνότητα των επιμολυσμένων κρασιών με μυκοτοξίνες ήταν ιδιαίτερα χαμηλή, ενώ οι Φουμονισίνες αναδείχθηκαν ως κυρίαρχες μυκοτοξίνες στα Ελληνικά κρασιά. Σύμφωνα με τα δεδομένα των προηγούμενων ενοτήτων, διαπιστώσαμε ότι το σύστημα καλλιέργειας επηρέασε τη πληθυσμιακή δομή των μαύρων ασπεργίλλων στους ελληνικούς αμπελώνες, και προχωρήσαμε στον έλεγχο της υπόθεσης, ότι οι διαφορές στη δομή του πληθυσμού μπορεί να σχετίζονται με την επιλογή ανθεκτικών σε μυκητοκτόνα στελεχών του μύκητα. Ο έλεγχος της υπόθεσης πραγματοποιήθηκε με τον προσδιορισμό των επιπέδων ευαισθησίας των απομονώσεων του μύκητα (A. uvarum, A. tubingensis, A. niger, και A. carbonarius) στα μυκητοκτόνα fluxapyroxad (SDHIs), pyraclostrobin (QoIs), tebuconazole- (DMIs), και fludioxonil (φαινυλοπυρρόλια). Οι απομονώσεις του μύκητα A. uvarum, που προέρχονταν κυρίως από συμβατικούς αμπελώνες, παρουσίασαν υψηλά επίπεδα ανθεκτικότητας και στις τέσσερις (4) ομάδες μυκητοκτόνων που ελέγχθηκαν. Αντιθέτως, οι απομονώσεις του μύκητα A. tubingensis, βρέθηκαν να είναι είναι ευαίσθητες στο pyraclostrobin, ενώ καταγράφηκαν χαμηλά επίπεδα ανθεκτικότητας στα μυκητοκτόνα tebuconazole, fludioxonil, και fluxapyroxad. Η αλληλούχιση των γονιδίων, που κωδικοποιούν τον βιοχημικό στόχο της κάθε ομάδας μυκητοκτόνων, αποκάλυψε την παρουσία των μεταλλάξεων H270Y, H65Q/S66P και G143A στα γονίδια sdhB, sdhD και cytb στις ανθεκτικές απομονώσεων του A. uvarum, αντίστοιχα. Αντίθετα, δεν ανιχνεύθηκε καμία μετάλλαξη στα γονίδια CYP51A και CYP51B, σε καμία από τις απομονώσεις του A. uvarum και A. tubingensis. Τα αποτελέσματα της ενότητας αυτής ενισχύουν την αρχική μας υπόθεση για την συμβολή της ανθεκτικότητας σε μυκητοκτόνα στην δομή του πληθυσμού των μαύρων ασπεργίλλων, ενώ η καταγραφή των μεταλλαγών H270Y, H65Q/S66P, και G143A στα γονίδια sdhB, sdhD, και cytb, αποτελούν πρώτη παγκόσμια αναφορά για το είδος A. uvarum. Στο τελευταίο κεφάλαιο της παρούσας διατριβής, μελετήθηκε η επίδραση διάφορων καλλιεργητικών πρακτικών (άρδευση, αποφύλλωση και αραιοραγία/πυκνοραγία) στη συχνότητα προσβολής από μύκητες γένους Aspergillus spp., στα ποιοτικά χαρακτηριστικά των σταφυλιών (TA, pH, και TSS), και στην διαμόρφωση του μικροβιώματος της καρπόσφαιρας, σε τρία βλαστικά στάδια (σχηματισμός βότρεων, περκασμός και ωρίμανση). Η συχνότητα προσβολής από μύκητες του γένους Aspergillus spp., βρέθηκε να είναι υψηλότερη κατά το στάδιο της πλήρους ωρίμανσης, ενώ παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφοροποιήσεις μεταξύ των επεμβάσεων. Ειδικότερα, παρατηρήθηκε υψηλή συχνότητα προσβολής από μύκητες του γένους Aspergillus στις επεμβάσεις άρδευσης (IR), χωρίς αποφύλλωση (NDF), και πυκνοραγίας (HBD), συγκριτικά με τις επεμβάσεις αραιοραγία (LBD), αποφύλλωση (DF) και χωρίς άρδευση (NIR). Τα αποτελέσματα της αλληλούχισης νέας γενιάς των μικροβιακών κοινοτήτων της καρπόσφαιρας, παρουσίασε σημαντικές διαφοροποιήσεις μεταξύ των βλαστικών σταδίων ανάπτυξης και των επεμβάσεων, ενώ παρατηρήθηκαν σημαντικές διακυμάνσεις στην α- και β- ποικιλότητα των μικροβιακών κοινοτήτων στο στάδιο της ωρίμανσης. Τέλος, η ανάλυση δικτύου μεταξύ των μικροβιακών κοινοτήτων της καρπόσφαιρας, επέδειξε την παρουσία μοτίβων αρνητικής συσχέτισης μεταξύ του Aspergillus και διάφορων βακτηριακών γενών (Streptococcus, Rhodococcus, Melitangium, Roseomnonas, και Belnapia), στις επεμβάσεις όπου ο Aspergillus βρέθηκε να μειώνεται σημαντικά (NIR, DF, LBD). Τα προαναφερθέντα βακτηριακά γένη είναι γνωστά για τις μυκοστατικές τους ιδιότητες, υποδηλώνοντας την συμβολή φυσικών μηχανισμών ελέγχου προσβολής από μύκητες του γένους Aspergillus spp.