Μελέτη μεγάλης κλίμακας της γονιδιακής έκφρασης της ελιάς (Olea europaea L.) σε συνθήκες καταπόνησης με NaCl

Abstract

Olive (Olea europaea L.) is one of the most important crops in the Mediterranean region. A significant part of the Mediterranean agricultural land is saline due to irrigation with low quality water which has negative effects on growth and productivity. Despite its economic significance, genomic information on olive tree is still lacking. An agronomic approach, which combined high throughput olive genomics with an experimental design simulating olive natural cultivation conditions, was used in order to investigate the molecular basis of olive to salt response. To this aim a 135-day NaCl stress experiment was set up with one year-old plants of a salt-tolerant (cv. Kalamon) and a salt-sensitive (cv. Chondrolia Chalkidikis) olive variety. Total RNA from root and leaf samples was extracted throughout the time course and used for microarray and RNA sequencing. A cDNA library from 25-day old olive seedlings (cv. Koroneiki) was constructed and 1121 unique ESTs were identified and used for the construction of custom DNA microarrays. Seven transcription factors related to salt stress were identified and comparative regulatory networks were constructed indicating differences in structure and complexity of the networks between the salt-sensitive and the salt-tolerant variety. Moreover two root and two leaves cDNA libraries of cv Kalamon were sequenced using the 454 GS FLX Titanium system in order to investigate the molecular basis of salt tolerance in olive after 90-day NaCl stress conditions and to enrich the very few sequence data currently available for the Olea europaea L. species. A total of 277.908 high quality transcripts were obtained and analyzed with bioinformatics tools for the identification of NaCl-stress related differentially expressed genes in root and leaves. Massively parallel sequencing of different cDNA libraries has provided large-scale information about the biological processes and molecular functions of transcripts in root and leaves. Comparative transcript profiling allowed the identification of differentially expressed genes.

Η ελιά (Olea europaea L.) είναι μια από τις σημαντικότερες καλλιέργειες στην περιοχή της Μεσογείου. Μεγάλο μέρος των καλλιεργούμενων εκτάσεων στην Μεσόγειο είναι υποβαθμισμένο εξαιτίας της χαμηλής ποιότητας του νερού άρδευσης, προκαλώντας αρνητικές επιπτώσεις στην αύξηση και την παραγωγικότητα των φυτών. Παρόλη την σημαντική και συνεχώς αυξανόμενη οικονομική σημασία της ελιάς, η γονιδιωματική της πληροφορία παραμένει ελλιπής. Έτσι, χρησιμοποιήθηκε μια αγρονομική προσέγγιση που συνδύασε την αλληλούχιση μεγάλης-κλίμακας (high-throughput sequencing) με πειραματικό σχεδιασμό που να προσομοιάζει τις φυσικές συνθήκες καλλιέργειας με σκοπό να μελετηθεί η μοριακή βάση της ανθεκτικότητας της ελιάς στην αλατότητα. Eκπονήθηκε πείραμα καταπόνησης με NaCl διάρκειας 135 ημερών, σε ενός έτους δενδρύλια ελιάς, ευαίσθητης (Χονδρολιάς Χαλκιδικής) και ανθεκτικής ποικιλίας (Καλαμών) στην αλατότητα. Το ολικό κυτταρικό RNA από φύλλα και ρίζα απομονώθηκε σε πέντε χρονικά σημεία του πειράματος και χρησιμοποιήθηκε για αναλύσεις μικροσυστοιχίας και αλληλούχισης μεγάλης κλίμακας. Κατασκευάστηκε και αλληλουχίθηκε βιβλιοθήκη cDNA από 25-ημερών σπορόφυτα ελιάς (cv Κορωνέικη) και χρησιμοποιήθηκαν 1121 μοναδικά ESTs για την κατασκευή μικροσυστοιχίας. Εντοπίστηκαν επτά μεταγραφικοί παράγοντες που σχετίζονται με καταπόνηση αλατότητας και κατασκευάστηκαν συγκριτικά ρυθμιστικά δίκτυα που υποδηλώνουν διαφορές στην δομή και στην πολυπλοκότητα των δικτύων ανάμεσα στην ανθεκτική και στην ευαίσθητη ποικιλία στην αλατότητα. Επιπλέον, τέσσερις cDNA βιβλιοθήκες από ρίζα και φύλλα ελιάς ποικιλίας Καλαμών αλληλουχήθηκαν με την πλατφόρμα 454-GS FLX Titanium με σκοπό την μελέτη της μοριακής βάσης της ανθεκτικότητας της ελιάς στην καταπόνηση με NaCl και ταυτόχρονα τον εμπλουτισμό του μικρού αριθμού γνωστών αλληλουχιών στο είδος Olea europaea L.. Συνολικά αλληλουχίθηκαν και αναλύθηκαν με βιοϋπολογιστικά προγράμματα 277.908 cDNAs υψηλής ποιότητας για τον εντοπισμό γονιδίων με σημαντικά διαφορετική έκφραση στη καταπόνηση με NaCl σε φύλλα και ρίζα. Η μαζική παράλληλη αλληλούχιση των cDNA βιβλιοθηκών παρείχε πληροφοριές μεγάλης κλίμακας σχετικά με τις βιολογικές διαδικασίες και τις μοριακές λειτουργίες των μεταγραφημάτων της ρίζας και των φύλλων ελιάς. Η συγκριτική ανάλυση των μεταγραφικών προφίλ επέτρεψε την αναγνώριση των μεταγραφημάτων με σημαντικά διαφορετική έκφραση.