Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για την ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση της δραστικής ουσίας ποσακοναζόλης σε εναιωρήματα

Abstract

The identification and quantitation of Active Pharmaceutical Ingredients’ (API) polymorphs in pharmaceutical formulations, such as suspensions, could be really challenging because of their aqueous phase and the contained low concentration of the APIs. In addition, the characterization of APIs’ polymorphs through chromatographic techniques, which could succeed low detection and quantitation limits, is impossible. Moreover, another issue, which is possible to be observed during the identification process of APIs’ polymorphism in pharmaceutical suspensions, is the quick polymorphic conversion of the APIs in the formulation.An API that is usually administered to patients as a pharmaceutical suspension is posaconazole. Posaconazole is commercially available as an oral suspension 40 mg/mL, as a 18 mg/mL sterile concentrate for solution for intravenous infusion and as 100 mg gastro-resistant tablets. It is a novel member of the triazole antifungal drugs, belonging to their second generation and it has the widest antifungal spectrum of all antifungal medicines. Until recently, 14 different forms of posaconazole have been recorded; more specifically, polymorphs I, II, III, IV, V, II-S, Y, A, S, N, an isopropanol solvate, a methanol solvate and a dioxane-water solvate, as well as the amorphous posaconazole have been described in literature. Among these forms, the polymorphic form I is the most stable and it is used for manufacturing posaconazole pharmaceutical suspensions.The direct analysis of posaconazole oral suspensions via X-Ray Powder Diffraction (XRPD) and Raman Spectroscopy leaded to diffractograms and Raman spectra of low quality; thus, the identification of API’s polymorphism was not possible. For this purpose, a method was developed for enhancing the signal-to-noise ratio in both techniques. According to this method, posaconazole oral suspensions were centrifuged and the precipitates were isolated. Subsequently, the precipitates were covered with a low-density polyehthylene (LDPE) cling film and their XRPD diffractograms and Raman spectra were recorded. Hence, posaconazole in its oral suspensions was identified as form-S. The search of the reason of the transformation of the initial posaconazole polymorph I to posaconazole polymorph S leaded to the conclusion that water is responsible for the polymorphic conversion. Furthermore, it was found that even the simple contact of posaconazole polymorph I with water triggers the conversion to form-S to a great extent. Succeeding complete wetting of posaconazole polymorph I with water, by homogenizing the water dispersion in a sonication bath for at least 10 min, resulted in a complete conversion to polymorph S. After filtration of the aqueous dispersion, the pure polymorph S was isolated and it was characterized by XRPD, Raman Spectroscopy, Attenuated Total Reflectance (ATR), Optical Microscopy, Differential Scanning Calorimetry (DSC) and Thermogravimetric Analysis (TGA).The XRPD diffractograms of posaconazole polymorphs S and I were used to determine their crystal lattices by applying the dichotomy method via PreDICT software. Both polymorphs were found to adopt the monoclinic crystal lattice. The dimensions of the unit cell of the crystal lattice of polymorph S were found a = 12.3799 Å, b = 6.3053 Å and c = 23.1258 Å, the angle β = 93.140ο and its volume V = 1802.47 Å3, while the axes’ dimensions of the unit cell of the crystal lattice of polymorph I were calculated equal to a = 12.5355 Å, b = 6.3481 Å and c = 22.7796 Å, the angle β = 96.387ο and its volume V = 1801.48 Å3. In Optical Microscopy, polymorph S was observed to form a net of crystals, connected loosely with each other, while they are surrounded by water molecules. The analysis of posaconazole polymorph S through DSC and TGA leaded to the conclusion that form-S is a hydrated form. Moreover, stoichiometric mixtures of posaconazole polymorph I with water were prepared and it was found that at least 2 mol water per 1 mol posaconazole polymorph I are required for the polymorphic conversion to form-S.The quantitation of polymorphs S and I via XRPD followed. For this purpose, posaconazole standard oral suspensions were prepared by diluting a 40 mg/mL initial oral suspension with Placebo. Then, the standard suspensions were centrifuged and the precipitates were isolated. For the construction of the calibration curve of polymorph S, the precipitates were covered with LDPE cling film, while for the calibration curve of polymorph I the precipitates were dried overnight, after removing the cling film, so that the conversion to the initial form I would be completed. After the analysis of the precipitates the characteristic peaks of polymorph S at 10.2o 2θ, polymorph I at 9.9o 2θ and the excipient titanium dioxide (TiO2), which was used as an internal standard, at 25.3o 2θ were integrated and the ratios of the peak intensities of each polymorph to the peak intensity of TiO2 were calculated, i.e. I10.2/I25.3 for polymorph S and I9.9/I25.3 for polymorph I. By using the optical evaluation method in the XRPD patterns, the detection limit (DL) of polymorph S was found equal to 2.0 mg/mL, while the quantitation limit (QL) was calculated equal to 6.0 mg/mL. For polymorph I, it was found DL = 3.0 mg/mL and QL = 9.0 mg/mL. The concentration of polymorph S in a 25 mg/mL posaconazole oral suspension was determined equal to (23.3 ± 1.7) mg/mL, while the concentration of polymorph I was found (21.6 ± 1.0) mg/mL. In a 40 mg/mL posaconazole oral suspension, which was found as a mixture of polymorphs S and I, their concentrations were found (22.1 ± 1.7) mg/mL and (19.6 ± 1.0) mg/mL, respectively. However, both XRPD quantification methods are lacking of accuracy, repeatability and intermediate precision, which is caused because of the preferred orientation of the crystals of the two polymorphs of the API and TiO2.The issue of preferred orientation was solved by using Raman spectroscopy. For the analysis, a special equipment was employed for the rotation of the sample. The peaks of polymorphs S and I at 738 cm-1 and 745 cm-1, respectively and the peak of TiO2 at 393 cm-1 were integrated and the ratios of the peak intensities of each polymorph to the peak intensity of TiO2 were calculated, i.e. I738/I393 for polymorph S and I745/I393 for polymorph I. The limits of detection and quantitation were calculated from the calibration curves data for polymorph S, DL = 1.9 mg/mL and QL = 5.9 mg/mL, while for polymorph I, DL = 2.2 mg/mL and QL = 6.6 mg/mL. The concentrations of polymorphs S and I in the 25 mg/mL posaconazole oral suspension were determined equal to (24.1 ± 0.5) mg/mL και (25.6 ± 0.6) mg/mL, respectively, while in the 40 mg/mL posaconazole oral suspensions, in which the API was identified as a mixture of both polymorphs, the concentrations of polymorphs S and I were found (25.4 ± 0.5) mg/mL και (14.7 ± 0.6) mg/mL, respectively. The developed quantitation methods for polymorphs S and I via Raman Spectroscopy were validated and it was found that they are characterized by excellent accuracy, precision (repeatability and intermediate precision), sensitivity, specificity and robustness.

Η ανίχνευση και ο ποσοτικός προσδιορισμός των πολυμόρφων των δραστικών ουσιών σε φαρμακοτεχνικές μορφές, όπως τα εναιωρήματα, είναι ιδιαίτερα επίπονες και απαιτητικές διαδικασίες εξαιτίας της υδατικής φύσης τους και της χαμηλής συγκέντρωσης των δραστικών ουσιών σε αυτά. Επίσης, ο χαρακτηρισμός του πολυμορφισμού δραστικών ουσιών είναι αδύνατος με τη χρήση χρωματογραφικών τεχνικών, οι οποίες θα μπορούσαν να εξασφαλίσουν πολύ χαμηλά όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης. Ένα ακόμα πρόβλημα, κατά την ταυτοποίηση του πολυμορφισμού των δραστικών ουσιών σε εναιωρήματα, αποτελεί η ταχύτατη μετατροπή των πολυμόρφων των δραστικών ουσιών που περιέχονται σε αυτές τις φαρμακοτεχνικές μορφές.Μία δραστική ουσία, η οποία χορηγείται συχνά στους ασθενείς υπό τη μορφή εναιωρήματος, είναι η ποσακοναζόλη. Η ποσακοναζόλη κυκλοφορεί υπό τη μορφή πόσιμου εναιωρήματος συγκέντρωσης 40 mg/mL, ως ενέσιμο διάλυμα για ενδοφλέβια χορήγηση σε συγκέντρωση 18 mg/mL και ως γαστροανθεκτικά δισκία παρατεταμένης αποδέσμευσης των 100 mg. Αποτελεί μέλος των αντιμυκητιασικών φαρμάκων της κατηγορίας των τριαζολών και ανήκει στη δεύτερη γενιά τους, διαθέτοντας το πιο ευρύ αντιμυκητιασικό φάσμα. Μέχρι σήμερα, έχουν καταγραφεί 14 διαφορετικές μορφές της ποσακοναζόλης: τα πολύμορφα I, II, III, IV, V, II-S, Y, A, S, N, οι επιδιαλυτωμένες μορφές της με ισοπροπανόλη, με μεθανόλη και με μίγμα διοξανίου με νερό και η άμορφη κατάστασή της. Από τις μορφές αυτές, το πολύμορφο I είναι το σταθερότερο και χρησιμοποιείται για την παρασκευή των εναιωρημάτων ποσακοναζόλης.Η απευθείας ανάλυση των εναιωρημάτων ποσακοναζόλης με Περιθλασιμετρία Ακτίνων-Χ Κόνεως (X-Ray Powder Diffraction, XRPD) και Φασματοσκοπία Raman οδήγησε σε περιθλασιογράμματα και φάσματα Raman, αντίστοιχα, χαμηλής ποιότητας, με αποτέλεσμα να είναι αδύνατος ο χαρακτηρισμός του πολυμορφισμού της δραστικής ουσίας. Για το λόγο αυτό, αναπτύχθηκε μέθοδος για την αύξηση του λόγου σήματος προς θόρυβο στις αναλύσεις με τις δύο τεχνικές. Σύμφωνα με τη μέθοδο αυτή, τα εναιωρήματα ποσακοναζόλης φυγοκεντρήθηκαν και απομονώθηκε το ίζημα, το οποίο στη συνέχεια, αναλύθηκε με XRPD και Φασματοσκοπία Raman, αφού πρώτα καλύφθηκε με μεμβράνη τροφίμων πολυαιθυλενίου χαμηλής πυκνότητας. Με τον τρόπο αυτό, η δραστική ουσία στα εναιωρήματα ποσακοναζόλης ανιχνεύθηκε υπό τη μορφή S.Η διερεύνηση της αιτίας της μετατροπής του αρχικού πολυμόρφου I της ποσακοναζόλης στο πολύμορφο S οδήγησε στο συμπέρασμα ότι το νερό είναι υπεύθυνο για την πολυμορφική μετάπτωση. Επίσης, βρέθηκε ότι η απλή επαφή του πολυμόρφου I της ποσακοναζόλης με το νερό οδηγεί σε μετατροπή προς το πολύμορφο S μεγάλου ποσοστού της αρχικής μορφής. Η επίτευξη καλής διαβροχής με ομογενοποίηση της υδατικής διασποράς του πολυμόρφου I σε λουτρό υπερήχων για τουλάχιστον 10 λεπτά είχε ως αποτέλεσμα την πλήρη μετατροπή στο πολύμορφο S. Μετά από διήθηση της υδατικής διασποράς, απομονώθηκε το καθαρό πολύμορφο S, το οποίο χαρακτηρίστηκε με XRPD, Φασματοσκοπία Raman, Φασματοσκοπία Εξασθενισμένης Ολικής Ανάκλασης (Attenuated Total Reflectance, ATR), Οπτική Μικροσκοπία, Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης (Differential Scanning Calorimetry, DSC) και Θερμοσταθμική Ανάλυση (Thermogravimetric Analysis, TGA).Από τα περιθλασιογράμματα XRPD των καθαρών πολυμόρφων S και I της ποσακοναζόλης και εφαρμόζοντας τη μέθοδο της διχοτόμησης μέσω του λογισμικού PreDICT, βρέθηκε ότι και τα δύο πολύμορφα υιοθετούν το μονοκλινές κρυσταλλικό πλέγμα. Οι διαστάσεις της μοναδιαίας κυψελίδας για το πολύμορφο S προσδιορίστηκαν a = 12.3799 Å, b = 6.3053 Å και c = 23.1258 Å, η γωνία β = 93.140ο και ο όγκος της V = 1802.47 Å3, ενώ οι πλευρές της μοναδιαίας κυψελίδας του πολυμόρφου I είχαν διαστάσεις a = 12.5355 Å, b = 6.3481 Å και c = 22.7796 Å, γωνία β = 96.387ο και όγκο ίσο με V = 1801.48 Å3. Με την οπτική μικροσκοπία παρατηρήθηκε ότι το πολύμορφο S σχηματίζει ένα δίκτυο κρυστάλλων που συνδέονται χαλαρά μεταξύ τους, ενώ περιβάλλονται από μόρια νερού. Από την ανάλυση του πολυμόρφου S με τις θερμικές τεχνικές, βρέθηκε ότι αποτελεί ένυδρη μορφή, ενώ από την παρασκευή στοιχειομετρικών μιγμάτων του πολυμόρφου I με το νερό, προσδιορίστηκε ότι απαιτούνται τουλάχιστον 2 mol νερού ανά 1 mol πολυμόρφου I για τη μετατροπή προς το πολύμορφο S.Ακολούθησε ο ποσοτικός προσδιορισμός των πολυμόρφων S και I με XRPD. Για το σκοπό αυτό, παρασκευάστηκαν πρότυπα εναιωρήματα ποσακοναζόλης από αραίωση αρχικού εναιωρήματος συγκέντρωσης 40 mg/mL με Placebo, τα οποία ακολούθως φυγοκεντρήθηκαν και απομονώθηκε το ίζημα. Για την κατασκευή καμπύλης βαθμονόμησης του πολυμόρφου S τα ιζήματα που απομονώθηκαν, καλύφθηκαν με τη μεμβράνη πολυαιθυλενίου χαμηλής πυκνότητας, ενώ για την κατασκευή της καμπύλης βαθμονόμησης του πολυμόρφου I, τα ιζήματα ξηράνθηκαν για μία ημέρα, ώστε να ολοκληρωθεί πλήρως η μετατροπή στο αρχικό πολύμορφο I και ακολούθησε η ανάλυσή τους χωρίς τη χρήση μεμβράνης. Για την κατασκευή των καμπυλών βαθμονόμησης, πραγματοποιήθηκε ολοκλήρωση των χαρακτηριστικών κορυφών του πολυμόρφου S στις 10.2ο 2θ, του πολυμόρφου I στις 9.9ο 2θ και του εκδόχου διοξειδίου του τιτανίου (TiO2), το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο, στις 25.3ο 2θ και υπολογίστηκαν οι λόγοι των εντάσεων των κορυφών κάθε πολυμόρφου προς την ένταση της κορυφής του TiO2, δηλαδή Ι10.2/Ι25.3 για το πολύμορφο S και I9.9/I25.3 για το πολύμορφο I. Με τη μέθοδο της οπτικής αξιολόγησης στα περιθλασιογράμματα XRPD, το όριο ανίχνευσης (Detection Limit, DL) του πολυμόρφου S βρέθηκε 2.0 mg/mL και το όριο ποσοτικοποίησης (Quantitation Limit, QL) 6.0 mg/mL, ενώ για το πολύμορφο I υπολογίστηκαν DL = 3.0 mg/mL και QL = 9.0 mg/mL. Σε εναιώρημα ποσακοναζόλης συγκέντρωσης 25 mg/mL, η συγκέντρωση του πολυμόρφου S προσδιορίστηκε ίση με (23.3 ± 1.7) mg/mL, ενώ του πολυμόρφου I βρέθηκε ίση με (21.6 ± 1.0) mg/mL. Σε εναιώρημα ποσακοναζόλης συγκέντρωσης 40 mg/mL, που αποτελούσε μίγμα των δύο πολυμόρφων, η συγκέντρωση του πολυμόρφου S υπολογίστηκε ίση με (22.1 ± 1.7) mg/mL και του πολυμόρφου I (19.6 ± 1.0) mg/mL. Διαπιστώθηκε, όμως, ότι οι μέθοδοι προσδιορισμού των δύο πολυμόρφων με XRPD υστερούν ως προς την ακρίβεια, την επαναληψιμότητα και την ενδιάμεση πιστότητα λόγω του προτιμώμενου προσανατολισμού των κρυστάλλων των δύο πολυμόρφων της δραστικής ουσίας και του TiO2.Με τη Φασματοσκοπία Raman, το πρόβλημα του προτιμώμενου προσανατολισμού υπερνικήθηκε. Για την ανάλυση χρησιμοποιήθηκε ειδική συσκευή για την περιστροφή του δείγματος. Ολοκληρώθηκαν οι κορυφές των πολυμόρφων S και I στους 738 cm-1 και 745 cm-1, αντίστοιχα, και του TiO2 στους 393 cm-1 και υπολογίστηκαν οι λόγοι των εντάσεων των κορυφών κάθε πολυμόρφου προς την ένταση της κορυφής του TiO2, δηλαδή I738/I393 για το πολύμορφο S και I745/I393 για το πολύμορφο I. Από τις καμπύλες βαθμονόμησης, τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης υπολογίστηκαν για το πολύμορφο S, DL = 1.9 mg/mL και QL = 5.9 mg/mL και για το πολύμορφο I, DL = 2.2 mg/mL και QL = 6.6 mg/mL. Οι συγκεντρώσεις των πολυμόρφων S και I, σε εναιώρημα ποσακοναζόλης 25 mg/mL, προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο αυτή ίσες με (24.1 ± 0.5) mg/mL και (25.6 ± 0.6) mg/mL, αντίστοιχα, ενώ οι συγκεντρώσεις τους στο εναιώρημα ποσακοναζόλης 40 mg/mL, που ήταν μίγμα των δύο πολυμόρφων υπολογίστηκαν ίσες με (25.4 ± 0.5) mg/mL και (14.7 ± 0.6) mg/mL, αντίστοιχα. Οι μέθοδοι ποσοτικού προσδιορισμού των πολυμόρφων S και I με Φασματοσκοπία Raman επικυρώθηκαν και βρέθηκε ότι χαρακτηρίζονται από άριστη ακρίβεια, πιστότητα (επαναληψιμότητα και ενδιάμεση πιστότητα), ευαισθησία, ειδικότητα και ευρωστία.