Μελέτη του μηχανισμού κατακράτησης στη χρωματογραφία υδρόφιλης αλληλεπίδρασης (HILIC) και ανάπτυξη μεθόδου προσδιορισμού υδατοδιαλυτών βιταμινών

Abstract

In the present study, the retention mechanism in HILIC was investigated based on the chromatographic behaviour of the water-soluble vitamins. For this purpose, diol-silica, bare silica and amino-silica were utilized, as stationary phases. The chromatographic parameters evaluated for each stationary phase were the eluent strength, the mobile phase pH, the presence of different buffer salts, the buffer salt concentration, the nature of the organic solvent and the column temperature. For detailed investigation of the retention mechanism, two models of partitioning and surface adsorption and a third model, which considers the solute-solvent-stationary phase interactions were examined for the degree-of-fitness on retention data. Moreover, a method was developed and validated for the analysis of water-soluble vitamins in a pharmaceutical preparation and a vitamin fortified drink. Based on the results derived from the fitness of the model equations on retention, and the thermodynamic data, it is confirmed that the retention mechanism in HILIC is a mixed mode with partitioning and surface adsorption operating synergistically. The amplitude of the water content at which surface adsorption becomes apparent is depended on the water layer thickness and the charge of the stationary phase, the charge of the analytes and the presence of buffer salt ions. For the neutral vitamins, the adsorption mechanism becomes apparent at ACN content ? 80% for the diol-silica column and at ACN content ? 75% for the bare silica and amino-silica columns. For analytes carrying the same charge with the stationary phase, the switching from partition to surface adsorption mechanism becomes evident at ACN content ? 85%, where electrostatic repulsion is weakened due to the preferable distribution of the salt ions into the aqueous layer. Finally, the surface adsorption mechanism is predominant for compounds being electrostatically attracted by the stationary phase. The investigation on the effect of different organic solvents on the retention behavior of water-soluble vitamins brings forward the conclusive evidence that hydrogen bonds contribute greatly to the retention mechanism. Following the criteria of resolution, peak symmetry, isocratic eluting conditions and the total analysis time, the diol-column was chosen for the quantitative determination of the water-soluble vitamins. The chromatographic conditions were as follows: ACN/H2O 90/10 (v/v), CH3COONH4 10 mM, TEA 20 mM, pH 5,0. In addition, the column temperature was set at 25 oC and the mobile phase flow rate at the value of 0,8 mL/min. The suitability of the chromatographic conditions was established according to the system suitability test. Validation was verified by method detection and quantitation limits, accuracy, inter- and intra-day precisions and vitamin recoveries from samples.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε ο μηχανισμός κατακράτησης της HILIC με βάση τη χρωματογραφική συμπεριφορά των υδατοδιαλυτών βιταμινών. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν οι στατικές φάσεις διόλης-πυριτίας, μη επικαλυμμένης πυριτίας και αμινο-πυριτίας. Οι χρωματογραφικές παράμετροι που μελετήθηκαν για κάθε στατική φάση ήταν η ισχύς του διαλύτη έκλουσης, το pH της κινητής φάσης, η συγκέντρωση του άλατος του ρυθμιστικού διαλύματος, η παρουσία διαφορετικών ρυθμιστικών διαλυμάτων, η φύση του οργανικού διαλύτη και η θερμοκρασία της στήλης. Για τη διερεύνηση του μηχανισμού κατακράτησης αξιολογήθηκε η προσαρμογή των δεδομένων κατακράτησης σε τρεις εξισώσεις που αφορούν το μηχανισμό κατανομής, το μηχανισμό επιφανειακής προσρόφησης και ένα τρίτο μοντέλο που συμπεριλαμβάνει τις αλληλεπιδράσεις του συστήματος αναλύτης-κινητή φάση-στατική φάση. Στη συνέχεια αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισμό των υδατοδιαλυτών βιταμινών σε δείγμα φαρμακευτικού σκευάσματος και βιταμινούχου αναψυκτικού. Με βάση τα αποτελέσματα που προκύπτουν από την εφαρμογή των τριών εξισώσεων-μοντέλων, σε συνδυασμό με τα θερμοδυναμικά δεδομένα της διατριβής, επιβεβαιώνεται ότι ο μηχανισμός κατακράτησης στην HILIC είναι μικτός με τους επιμέρους μηχανισμούς κατανομής και επιφανειακής προσρόφησης να δρουν συνεργιστικά. Το εύρος της περιεκτικότητας σε ύδωρ στο οποίο λαμβάνει χώρα επιφανειακή προσρόφηση εξαρτάται από τον όγκο της σχηματιζόμενης στιβάδας ύδατος, το φορτίο της στατικής φάσης και των ενώσεων και την παρουσία ιόντων του άλατος του ρυθμιστικού διαλύματος. Για τις ουδέτερες βιταμίνες, η μετάβαση από το μηχανισμό κατανομής στο μηχανισμό επιφανειακής προσρόφησης λαμβάνει χώρα σε ποσοστό ACN ? 80% για τη στήλη διόλης-πυριτίας και σε ποσοστό ACN ? 75% για τις στήλες μη επικαλυμμένης πυριτίας και αμινο-πυριτίας. Η μετάβαση από το μηχανισμό κατανομής στο μηχανισμό επιφανειακής προσρόφησης για ενώσεις που φέρουν ομώνυμο φορτίο με τη στήλη λαμβάνει χώρα σε ποσοστά ACN ? 85%, όπου μειώνεται αισθητά η ηλεκτροστατική άπωση λόγω της προτιμώμενης κατανομής των ιόντων του άλατος στην υδατική στιβάδα. Στις ενώσεις που έλκονται ηλεκτροστατικά από την επιφάνεια της στατικής φάσης κυριαρχεί ο μηχανισμός της επιφανειακής προσρόφησης μέσω ιονανταλλαγής. Από τη μελέτη της επίδρασης διαφορετικών οργανικών διαλυτών στην κατακράτηση των υδατοδιαλυτών βιταμινών αναδεικνύεται η σημαντική συνεισφορά των δεσμών υδρογόνου στο μηχανισμό κατακράτησης. Με κριτήρια τη διαχωριστική ικανότητα, τη συμμετρία των χρωματογραφικών κορυφών, τις ισοκρατικές συνθήκες έκλουσης και το συνολικό χρόνο ανάλυσης, επιλέχθηκε η στήλη διόλης-πυριτίας για τον ποσοτικό προσδιορισμό των υδατοδιαλυτών βιταμινών. Οι χρωματογραφικές συνθήκες ήταν οι εξής: ACN/H2O 90/10 (v/v), CH3COONH4 10 mM, TEA 20 mM, pH 5,0. Επιπλέον, η θερμοκρασία της στήλης ήταν 25 oC, και η ταχύτητα ροής της κινητής φάσης ίση προς 0,8 mL/min. Η καταλληλότητα των χρωματογραφικών συνθηκών επιβεβαιώθηκε με βάση τη δοκιμή καταλληλότητας συστήματος. Η επικύρωση της αναλυτικής μεθόδου πραγματοποιήθηκε λαμβάνοντας υπόψη τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης, την επαναληψιμότητα της μεθόδου την ίδια ημέρα και μεταξύ διαφορετικών ημερών και τις ανακτήσεις των βιταμινών από τα δείγματα.