Biological activities and technological exploitation of alkannin/shikonin derivatives and Boraginaceae species

Abstract

Alkannins and shikonins are a group of naphthoquinone-based molecules with potent biological activities, that are commonly found in the roots of several boraginaceous plants. The present doctoral thesis aimed to (a) investigate the effect of alkannin/shikonin (A/S) and their derivatives on obesity/diabetes, skin cell proliferation, as well as bacterial pathogens and (b) technologically exploit the regenerative capacity of these hydroxynaphthoquinones through the development and biological characterization of drug-loaded polymeric scaffolds to serve as potential bioactive wound dressings. Regarding the biology part, several A/S compounds and their parent moiety, naphthazarin, were examined in order to approximate a structure-activity relationship (SAR) by using two model systems, namely 3T3-L1 pre-adipocyte cells and C. elegans nematode. The experiments on 3T3-L1 cells revealed that alkannin and shikonin treatment resulted in an attenuated adipogenesis with a decreased number of formed lipids. By contrast, derivatives lacking the side chain hydroxyl group demonstrated a larger number of mature adipocytes. In C. elegans experiments, it was first attempted to assess the inhibitory effect of A/S derivatives in the form of an hexane extract and an isolated mixture of A/S derivatives from A. tinctoria roots on fat accumulation, however no inhibitory activity was observed. Instead, a drastic shortage of nematode survival was witnessed. Therefore, as a next step, the previously mentioned hydroxynaphthoquinones were tested against C. elegans for their nematocidal activity, to identify which derivative(s) is/are responsible for the toxic effects. The results suggested that naphthazarin showed the most pronounced nematocidal activity, followed by β,β-dimethyl-acryl-shikonin and isovaleryl-shikonin. Additionally, a SAR study was also performed for a series of A/S derivatives to explore the impact of the various naphthoquinone-based structures on the viability/proliferation of Hs27 fibroblasts. The cell viability assays indicated that the acylated compounds together with the dimeric A/S derivative elicited an increased cell proliferation after three days of cell culture. On the contrary, the two enantiomers, alkannin and shikonin, displayed a significant toxicity even at relatively low concentrations (500 nM). Concerning the antibacterial evaluation of the above A/S compounds, it was shown that the chiral pair A/S together with acetyl-shikonin exhibited the most potent antibacterial activity as compared to the more lipophilic derivatives. With respect to the technology part, the present work involved the fabrication of polymeric scaffolds (CA, PCL, PHB, PLGA, and PLLA), loaded with a mixture of A/S derivatives via the electrospinning technique, and the subsequent evaluation of their physicochemical and biological characteristics. In general, all scaffolds were successfully fabricated with average diameters varying between 360 nm (CA samples) and 1.47 μm (PHB samples). CA and PHB scaffolds exhibited a bead-free fibrous network, whereas electrospinning of PCL, PLGA and PLLA resulted in the formation of beads along the fibers. The physicochemical characteristics of all scaffolds were satisfactory, though CA fiber mats showed a more favored profile. In relation to the biological assessment, CA and PHB samples (containing small amounts of A/S mixture) led to an enhanced attachment of Hs27 cells with increased metabolic activity, while samples with high drug amounts elicited a potent antibacterial activity.

Η αλκαννίνη (Α) και η σικονίνη (Σ) είναι δύο εναντιομερείς υδροξυναφθοκινόνες που βιοσυντίθενται στις ρίζες διαφόρων φυτών της οικογένεια Boraginaceae και οι οποίες έχουν γίνει ιδιαίτερα γνωστές τις τελευταίες δεκαετίες χάριν στις σημαντικές βιολογικές δράσεις που παρουσιάζουν. Η διδακτορική αυτή διατριβή αποσκοπούσε στη διερεύνηση της επίδρασης των Α/Σ και των παραγώγων τους (α) στην παχυσαρκία και τον διαβήτη, (β) στην επαγωγή του πολλαπλασιασμού των δερματικών κυττάρων και (γ) στην αναστολή της ανάπτυξης παθογόνων μικροοργανισμών. Επίσης, στόχος ήταν να αξιοποιήσει τεχνολογικά τις επουλωτικές και αναγεννητικές ιδιότητες των βιοδραστικών αυτών μορίων, αναπτύσσοντας πολυμερικά ικριώματα ιστομηχανικής ως φορείς για τις παραπάνω ναφθοκινόνες και πραγματοποιώντας την αξιολόγηση των βιολογικών τους ιδιοτήτων. Αναφορικά με τη μελέτη των βιολογικών ιδιοτήτων, χρησιμοποιήθηκαν διάφορα παράγωγα Α/Σ, καθώς και η μητρική τους ένωση ναφθαζαρίνη, προκειμένου να μελετηθεί η σχέση δομής-δραστικότητάς τους κατά τη διάρκεια in vitro και in vivo πειραμάτων σε πρo-λιποκύτταρα 3T3-L1 και στο νηματοειδές Caenorhabditis elegans, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αλκαννίνη και η σικονίνη, κατάφεραν να αναστείλουν τη λιπογένεση (σε συγκέντρωση 1 μΜ) σε μεγαλύτερο βαθμό συγκριτικά με τα υπόλοιπα παράγωγα. Τα παραπάνω ευρήματα αποτυπώθηκαν τόσο στα πειράματα με τη χρώση ORO staining, όσο και σε αυτά της RT-PCR. Σε ότι αφορά το C. elegans, διαπιστώθηκε απουσία αντιλιπογενετικής δράσης, ενώ παρατηρήθηκε σημαντική τοξικότητα, οδηγώντας σε δραστική μείωση της επιβίωσης του νηματοειδούς. Η ανάλυση των δεδομένων έδειξε ότι η ναφθαζαρίνη προκάλεσε τη μεγαλύτερη τοξικότητα στο C. elegans, ακολουθούμενη από τη β,β-διμεθυλο-ακρυλο-σικονίνη και την ισοβαλερυλο-σικονίνη. Αναφορικά με την επίδραση των ναφθοκινονών στη βιωσιμότητα/πολλαπλασιασμό των κυττάρων Hs27, αλλά και την ανάπτυξη των βακτηρίων, S. aureus και S. epidermidis, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι εστέρες Α/Σ, μαζί με τα διμερή Α/Σ οδήγησαν σε πολλαπλασιασμό των κυττάρων μετά από τις τρεις ημέρες, ενώ αντίθετα οι εναντιομερείς ναφθοκινόνες προκάλεσαν μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας, ακόμα και σε χαμηλές συγκεντρώσεις (500 nM). Σχετικά με τα πειράματα ανάπτυξης των βακτηρίων, οι Α/Σ και η ακετυλο-σικονίνη εμφάνισαν τη μεγαλύτερη αντιβακτηριακή δράση συγκριτικά με τα υπόλοιπα πιο λιπόφιλα παράγωγα. Το τεχνολογικό κομμάτι της διατριβής αφορούσε στην ανάπτυξη ικριωμάτων ιστομηχανικής με χρήση διαφόρων πολυμερών (CΑ, PCL, PHB, PLGA, and PLLA), μέσω της τεχνικής της ηλεκτροστατικής ινοποίησης. Στα παραπάνω βιοϋλικά ενσωματώθηκε μίγμα παραγώγων Α/Σ και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε χαρακτηρισμός των παρασκευασθέντων νανοϊνών ως προς τις φυσικοχημικές και βιολογικές τους ιδιότητες. Συνολικά όλα τα ικριώματα παρασκευάστηκαν επιτυχώς εμφανίζοντας μέσα μεγέθη ινών μεταξύ 360 nm (δείγματα CA) και 1.47 μm (δείγματα PHB). Τα ικριώματα με βάση τα πολυμερή CA και PHB παρουσίασαν ινώδεις μορφολογίες χωρίς το σχηματισμό χαντρών (beads), ενώ αντίθετα αυτά τα οποία αποτελούνταν από PCL, PLGA και PLLA σχημάτισαν χάντρες κατά μήκος των ινών. Σχετικά με τη βιολογική αξιολόγηση, τα CA και PHB ικριώματα που περιείχαν μικρές ποσότητες (<1% w/w) μίγματος παραγώγων Α/Σ κατόρθωσαν να ενισχύσουν την κυτταρική προσκόλληση στις επιφάνειές τους, αυξάνοντας παράλληλα την κυτταρική βιωσιμότητα και τον πολλαπλασιασμό. Επιπλέον, κατά τη μελέτη της αντιβακτηριακής δράσης των ικριωμάτων, διαπιστώθηκε ότι τα δείγματα που περιείχαν μεγαλύτερες ποσότητες μίγματος παραγώγων Α/Σ (π.χ. 5% w/w) ήταν δραστικά έναντι των βακτηρίων, όπως B. subtilis, M. luteus, S. aureus και S. epidermidis.