Μικροβιακή παραγωγή του βιοαποικοδομήσιμου πολυ(3-υδροξύ βουτυρικού) εστέρα (PHB) με στοχευμένες μοριακές ιδιότητες: πειραματική βελτιστοποίηση και μαθηματική προσομοίωση

Abstract

In view of the innumerable applications of plastics, biodegradable polymers are urgently needed so that the adverse their environmental effects can be ameliorated. Polyhydroxyalkanoates (PHAs) is a class of biodegradable polymers that are produced by various bacterial species as energy-carbon reserves. PHAs exhibit excellent biodegradability, biocompatibility and zero-toxicity characteristics. Moreover, PHAs are made from renewable sources. However, a major problem in the their commercialization is their high production cost. As a result, they are mostly employed in biomedical applications. Therefore, research and development efforts leading to the economical production of PHAs are of utmost significance. In the present dissertation, the wild-type strain Alcaligenes latus was employed for the production of poly(3-hydroxybutyrate) (PHB). The process was thoroughly investigated in terms of nutritional and cultivation conditions under batch and fed-batch fermentation policies. The effect of key process variables on the biomass growth rate, the PHB content and its associated MWD, were analyzed in a comprehensive way. It was shown that a polyester with tailor-made molecular properties can be produced via an optimal selection of the controlling variables, under batch conditions. Moreover, a single-shot fed-batch fermentation policy that maximized the polymer to saccharose yield was applied. In addition, the overall PHB concentration was enhanced by the application of a continuous substrate feeding regime. On the other hand the maximum weight average molecular weight was achieved under low biomass growth rate. For the recovery of the intracellular product a combined mechanical/chemical cells post-treatment process (i.e., cells disruption by sonication and polymer extraction by chloroform) that maximized the PHB recovery efficiency was experimentally identified. Moreover, the ability of Alcaligenes latus cells to grow on lactose from cheese whey as the only available carbon source and accumulate PHB efficiently was demonstrated for the first time. The mathematical simulation of A. latus cultures was performed using a ‘multi-scale’ modelling approach, consisting of three different sub-models: kinetic, metabolic and macroscopic. The present dissertation demonstrates a strategy of reducing the overall production cost by producing PHB efficiently under optimized fed-batch conditions, maximum polymer recovery and by utilizing alternative inexpensive raw materials.

Μπροστά στις αναρίθμητες εφαρμογές των πλαστικών υλικών, τα βιοαποικοδομήσιμα πλαστικά θεωρούνται η λύση για την αντιμετώπιση των περιβαλλοντικών επακόλουθων τους. Οι πολύ(ύδροξυ αλκανοϊκοί) εστέρες (PHAs) αποτελούν μια οικογένεια πλήρως βιοαποικοδομήσιμων πολυμερών, που σχηματίζονται στο κυτταρόπλασμα μικροοργανισμών. Παρουσιάζουν εξαιρετική βιοσυμβατότητα και καθόλου τοξικότητα, ενώ παράγονται από ανανεώσιμες πρώτες ύλες. Το εμπόδιο στην πλήρη εμπορευματοποίηση τους είναι το υψηλό κόστος παραγωγής, με αποτέλεσμα να χρησιμοποιούνται κατά το παρόν σε περιορισμένες εφαρμογές. Συνεπώς, η ανάπτυξη νέων μεθόδων παραγωγής αποτελεί ζήτημα τεράστιας σημασίας. Στην παρούσα διατριβή το βακτήριο Alcaligenes latus χρησιμοποιείται για την παραγωγή του πολύ(3-ύδροξυ βουτυρικού) εστέρα (PHB). Η μελέτη πραγματοποιείται με βάση τις σημαντικότερες διατροφικές και λειτουργικές παραμέτρους κάτω από ασυνεχείς και ημισυνεχείς συνθήκες καλλιέργειας. Η επίδραση των παραμέτρων στην ανάπτυξη των κυττάρων, στη συσσώρευση PHB και στα μοριακά χαρακτηριστικά του, μελετάται διεξοδικά. Βρέθηκε ότι κάτω από ασυνεχείς συνθήκες, πολυεστέρες με στοχευμένες μοριακές ιδιότητες μπορούν να παραχθούν. Επίσης, εφαρμόστηκε μια απλή πολιτική τροφοδοσίας/αραίωσης με σκοπό τη μεγιστοποίηση της απόδοσης της παραγωγής PHB. Η συγκέντρωση του βιοπολυμερούς ενισχύθηκε περαιτέρω με την εφαρμογή μιας συνεχούς πολιτικής τροφοδοσίας. Από την άλλη πλευρά, το μέγιστο μέσο κατά βάρος μοριακό βάρος επετεύχθη κάτω από συνθήκες μικρής ανάπτυξης της βιομάζας. Για την ανάκτηση του ενδοκυττάριου PHB ο συνδυασμός μηχανικής διάρρηξης των κυτταρικών μεμβρανών με υπέρηχους και χημικής εκχύλισης του με χλωροφόρμιο εντοπίστηκε πειραματικά να μεγιστοποιεί την αποτελεσματικότητα ανάκτησης. Επίσης, για τη μείωση του κόστους παραγωγής του PHB, η δυνατότητα του A. latus να μεταβολίζει τη λακτόζη από τυρόγαλα ως τη μόνη πηγή άνθρακα και να συσσωρεύει PHB σε υψηλά ποσοστά παρουσιάζεται για πρώτη φορά. Η μαθηματική προσομοίωση των καλλιεργειών πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια ολοκληρωμένη μαθηματική προσέγγιση, αποτελούμενη από τρία διαφορετικά υπό-μοντέλα: κινητικό, μεταβολικό και μακροσκοπικό. Η παρούσα διατριβή περιγράφει μια στρατηγική βελτιστοποίησης της παραγωγής του PHB υπό βέλτιστες ημισυνεχείς συνθήκες λειτουργίας, με μέγιστη αποτελεσματικότητα ανάκτησης και παράλληλα με την αξιοποίηση φθηνών και εναλλακτικών πρώτων υλών.