Μελέτη μεταγραφώματος της οδοντογενούς κερατινοκύστης

Abstract

Aim: Odontogenic keratocyst (OKC) has great research and clinical interest, due to its high frequency and aggressive behavior, i.e., growth potential within jaw bones and high recurrence rate. OKC may appear as a single lesion (sporadic OKC) or as a manifestation of Nevoid Basal Cell Carcinoma Syndrome (syndromic OKC). The aim of the present study is to perform a) transcriptomics analysis of the whole OKC via RNA-sequencing (RNA-seq), b) comparison of the transcriptome of primary cases and recurrences, c) comparison of the transcriptome of sporadic and syndromic OKC, d) validation of the RNA-seq results via real-time Polymerase Chain Reaction (qPCR) and immunohistochemistry, and e) intersection of the results of the present study with those obtained by a previous microarray-based study (GSE38494), and f) comparison of the immunohistochemical profile of syndromic and sporadic OKC. Methods: The study material consisted of formalin-fixed paraffin-embedded tissues of 21 OKC cases and 6 dental follicles of impacted teeth. The samples had been fixed in formalin for up to 48 hours and had been stored for up to 20 years. Total RNA was extracted, followed by RNase H-based rRNA depletion. The library preparation protocol utilized random hexamers for first strand priming. For 27 samples, 150-bp paired-end RNA-sequencing was implemented using an Illumina Hiseq4000 sequencer (Illumina Inc., San Diego, CA). A second run of 150-bp paired-end RNA-sequencing was applied for 7 samples using NextSeq 500 sequencer (Illumina Inc., San Diego, CA). %Q30 Phred score was calculated for the quality control of sequencing results. Principal Component Analysis and Euclidean Distance Analysis were performed to identify outliers. Finally, RNA-seq data from 18 cases were included in downstream bioinformatics analysis. Differential gene expression was evaluated using the DEsSeq2 algorithm, setting the significance threshold as i) False Discovery Rate (FDR)-adjusted p-value<0.05, ii) |log2[fold-change (FC)]|>1, iii) base mean of DESeq2's normalized counts>20. Three generations of enrichment analysis were performed to identify Gene Ontologies and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathways that were overrepresented among the upregulated and downregulated genes. Real-time Polymerase Chain Reaction was applied as a validation screen method of the induction levels of ALDH3A1, ATP12A, EPCAM, FETUB, GRHL3, OVOL1, SERPINB3, TACSTD2, and TP63. Immunohistochemical analysis was performed to verify the RNA-seq results at the protein level and to spatially map the expression of p63, SOX2, KLF4, OVOL1, IRF6, TACSTD2/TROP2 and E-cadherin. The GEO2R online platform was implemented, with default settings, to extract the differentially expressed genes (DEGs) of the previous microarray-based transcriptomics study (GSE38494). Next, we searched MEDLINE/Pubmed, Web of Science, EMBASE via OVID and grey literature for publications in the English language that compared the immunohistochemical profile of the sporadic and syndromic OKC subtype. The studies were qualitatively assessed using the Critical Appraisal Tool for Case Series proposed by Joanna Briggs Institute. Sensitivity and Specificity, Positive and Negative Likelihood Ratio, Diagnostic Odds Ratio and Area Under the Curve and pooled estimates were calculated, using a random effects model. Results: On average, RNA-seq generated 19.3 million paired-end reads, of which a median of 73.5% of reads per sample was uniquely mapped to the human genome. The count of total reads, mapped reads and uniquely mapped reads did not differ significantly between samples stored for up to 36 months in comparison with samples stored for more than 82 months. 2,654 and 2,427 DEGs were captured to characterize the transcriptome of sporadic and syndromic OKCs, respectively. Gene ontologies related to “epidermis/skin development” and “keratinocyte/epidermal cell differentiation” were enriched among the upregulated genes (KRT10, NCCRP1, TP63, GRHL3, SOX21), while “extracellular matrix (ECM) organization” (ITGA5, LOXL2) and “odontogenesis” (MSX1, LHX8) Gene Ontologies were overrepresented among the downregulated genes in OKC. Moreover, several metabolic pathways were overrepresented among the upregulated genes, e.g., “arachidonic acid metabolism” (ALOX12B, PLA2G4E) and “glutathione metabolism” (GGT6, RRM1), whereas genes related to cell-matrix adhesion were downregulated (PECAM1, VCAM1). Interestingly, upregulation of various embryonic stem cells (ESCs) markers (EPHA1, SCNN1A) and genes committed in cellular reprogramming (SOX2, KLF4, OVOL1, IRF6, TACSTD2, CDH1) was found in OKC. These findings were highly shared between sporadic and syndromic OKCs. qPCR confirmed the induction of ALDH3A1, ATP12A, EPCAM, FETUB, GRHL3, OVOL1, SERPINB3, TACSTD2, and TP63 in OKC. Immunohistochemistry verified SOX2, KLF4, OVOL1, IRF6, TACSTD2/TROP2, CDH1/E-cadherin, and p63 expression predominantly in the OKC suprabasal epithelial layers. In addition, we observed a considerable overlap by intersecting the DEGs dataset obtained from this study with the DEG dataset captured by a previous microarray-based study (GSE38494) and noticed the enrichment of Gene Ontologies related to epidermis development and keratinocyte differentiation among the overlapping upregulated genes. The qualitative analysis phase of the systematic review included 71 studies reporting data about the immunoexpression of 93 markers. Risk of bias was high in 34 studies, moderate in 22 studies, and low in 15 studies. 25 studies reported differential expression of 29 markers in the form of higher number of positive cells or/and greater staining intensity in syndromic OKCs. Meta-analysis for bcl-2, Cyclin D1, CD56, CK18, p53 and PCNA showed that none of those markers is distinguishable between syndromic and sporadic OKCs, in a 95% confidence interval. Conclusions: The results of the present study are in accordance with the pertinent literature regarding the utility of formalin-fixed paraffin-embedded tissues, stored for up to 20 years, in RNA-seq-based experiments. Our findings indicate a highly shared gene expression program between the sporadic (either primary cases or recurrences) and the syndromic OKCs. The OKC transcriptome is characterized by a prominent epidermal and dental epithelial fate, a repressed dental mesenchyme fate, combined with deregulation of the ECM organization, and enhanced stemness gene signatures. Moreover, significant upregulation of several metabolic pathways was observed in the transcriptome of OKC and could be linked to its locally aggressive behavior. On the other hand, the downregulation of cell-matrix adhesion mediators in OKC is in alignment with the microscopically noticed detachment of its epithelium from the underlying cystic wall. Core pluripotency factors (SOX2, KLF4), genes committed in cellular reprogramming (OVOL1, IRF6) or induced during early (CDH1/E-cadherin) or intermediate (TACSTD2/TROP2) reprogramming stages, were predominantly expressed in the suprabasal cells of OKC epithelium. Finally, there are no published immunohistochemical markers that can discriminate between syndromic and sporadic OKCs.

Σκοπός: Η οδοντογενής κερατινοκύστη (ΟΚΚ) εμφανίζει μεγάλο κλινικό και ερευνητικό ενδιαφέρον, λόγω της υψηλής συχνότητάς και της επιθετικής βιολογικής της συμπεριφοράς, δηλαδή της τάσης της να καταλαμβάνει μεγάλη έκταση στις γνάθους και να υποτροπιάζει. Επίσης, εκτός από το να αναπτύσσεται ως μοναδική βλάβη σε έναν ασθενή (σποραδική ΟΚΚ), μπορεί να αποτελεί εκδήλωση του Συνδρόμου Σπιλοειδών Βασικοκυτταρικών Καρκινωμάτων (συνδρομική ΟΚΚ). Σκοπός της μελέτης είναι να γίνει: α) ανάλυση του μεταγραφώματος του ολικού ιστού της ΟΚΚ με τη μέθοδο της RNA-αλληλούχησης (RNA-sequencing, RNA-seq), β) σύγκριση του μεταγραφώματος των πρωτοπαθών βλαβών και των υποτροπών της ΟΚΚ, γ) σύγκριση του μεταγραφώματος των σποραδικών και συνδρομικών ΟΚK, δ) έλεγχος επιβεβαίωσης των αποτελεσμάτων της RNA-seq με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (real-time Polymerase Chain Reaction, qPCR) και την ανοσοϊστοχημική μέθοδο, ε) σύγκριση των αποτελεσμάτων της RNA-seq με τα δεδομένα προηγούμενης μελέτης που εξέτασε το μεταγράφωμα της ολικής ΟΚΚ με τη μέθοδο των μικροσυστοιχιών (GSE38494) και στ) σύγκριση του ανοσοϊστοχημικού προφίλ των σποραδικών και συνδρομικών ΟΚK. Μέθοδοι: Το υλικό της μελέτης αποτελείτο από τους ιστούς 21 ΟΚΚ και 6 οδοντοθυλακίων εγκλείστων δοντιών (ΟΘΕ), που ήταν μονιμοποιημένοι στη φορμόλη για έως 48 ώρες και εγκιβωτισμένοι στην παραφίνη για έως 20 έτη. Έγινε απομόνωση του ολικού RNA, εξάντληση του rRNA με τη μέθοδο της RNase Η και κατασκευή της cDNA βιβλιοθήκης με τη χρήση τυχαίων εξαμερών εκκινητών. Πραγματοποιήθηκε διπλής κατεύθυνσης αλληλούχηση (μήκος ανάγνωσης 150bp) των 27 βιβλιοθηκών στο μηχάνημα HiSeq 4000 (Illumina Inc., San Diego, CA). Σε 7 βιβλιοθήκες επαναλήφθηκε δεύτερος κύκλος αλληλούχησης στο μηχάνημα NextSeq 500 (Illumina Inc., San Diego, CA). Η ποιότητα της αλληλούχησης ελέγχθηκε με το %Q30 Phred score. Έγινε ανάλυση κυρίων συνιστωσών και ιεραρχική συσταδοποίηση με Ευκλείδεια απόσταση για τον έλεγχο ύπαρξης ακραίων δειγμάτων. 18 περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκαν στη βιοπληροφορική ανάλυση. Η ανίχνευση των διαφορικώς εκφραζόμενων γονιδίων (ΔΕΓ) πραγματοποιήθηκε με τον αλγόριθμο DESeq2, χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα όρια στατιστικής σημαντικότητας: i) False Discovery Rate (FDR)-adjusted p-value <0,05, ii)|log2Fold-Change (FC)|>1, iii) μέση τιμή των DESeq2’s normalized counts>20. Εφαρμόστηκαν 3 γενιές ανάλυσης εμπλουτισμού για τον εντοπισμό των γονιδιακών οντολογιών και των Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) μονοπατιών που ήταν υπερεκπροσωπημένα ανάμεσα στα επαγόμενα και κατεσταλμένα γονίδια. Έγινε έλεγχος της επαγωγής των γονιδίων ALDH3A1, ATP12A, EPCAM, FETUB, GRHL3, OVOL1, SERPINB3, TACSTD2, και TP63 με τη μέθοδο της qPCR και ανοσοϊστοχημικός έλεγχος της έκφρασης των πρωτεϊνών p63, SOX2, KLF4, OVOL1, IRF6, TACSTD2/TROP2 και E-cadherin. Μέσω της διαδικτυακής πλατφόρμας GEO2R, με τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις, συγκεντρώθηκαν τα ΔΕΓ που είχαν βρεθεί στην προηγούμενη μελέτη μεταγραφώματος με τη μέθοδο των μικροσυστοιχιών (GSE38494). Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε συστηματική ανασκόπηση της αγγλόφωνης βιβλιογραφίας μέσω των βάσεων δεδομένων MEDLINE/Pubmed, Web of Science, EMBASE μέσω OVID, καθώς και στην γκρίζα βιβλιογραφία, αναφορικά με τις μελέτες που συγκρίνουν το ανοσοϊστοχημικό προφίλ της σποραδικής και συνδρομικής ΟΚΚ. Η ποιοτική αξιολόγηση των μελετών έγινε με το Εργαλείο Κριτικής Αξιολόγησης για σειρές περιστατικών του Ινστιτούτου Joanna Briggs. Η ευαισθησία, η ειδικότητα, ο λόγος θετικών και αρνητικών πιθανοτήτων, ο λόγος διαγνωστικών πιθανοτήτων, η περιοχή κάτω από την καμπύλη και οι συνολικές εκτιμήσεις υπολογίστηκαν εφαρμόζοντας το μοντέλο τυχαίων επιδράσεων. Αποτελέσματα: Προέκυψαν κατά μέσο όρο 19,3 εκατομμύρια paired-end reads ανά δείγμα, εκ των οποίων 73,5% (διάμεση τιμή) reads/δείγμα αντιστοιχήθηκαν μοναδικά στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στα ολικά reads ή σε αυτά που αντιστοιχήθηκαν στο γονιδίωμα αναφοράς μεταξύ των πρόσφατα (≤36 μήνες) αποθηκευμένων και των παλαιότερων (≥82 μήνες) δειγμάτων. Μεταξύ των ΔΕΓ που ανιχνεύθηκαν στους δύο κύκλους αλληλούχησης παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική επικάλυψη. Ανιχνεύθηκαν 2654 και 2427 ΔΕΓ που χαρακτήριζαν το μεταγράφωμα της σποραδικής και της συνδρομικής ΟΚΚ, αντίστοιχα, συγκριτικά με το ΟΘΕ. Οι γονιδιακές οντολογίες που σχετίζονται με την «ανάπτυξη επιδερμίδας/δέρματος» και τη «διαφοροποίηση κερατινοκυττάρων/επιδερμιδικών κυττάρων» ήταν εμπλουτισμένες μεταξύ των επαγόμενων γονιδίων (KRT10, NCCRP1, TP63, GRHL3, SOX21), ενώ οι γονιδιακές οντολογίες «οργάνωσης της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (ΕΘΟ)» (ITGA5, LOXL2) και της «οδοντογένεσης» (MSX1, LHX8) ήταν εμπλουτισμένες μεταξύ των κατεσταλμένων γονιδίων στην ΟΚΚ. Επίσης, παρατηρήθηκε επαγωγή γονιδίων που σχετίζονται με το μεταβολισμό, για παράδειγμα του αραχιδονικού οξέος (ALOX12B, PLA2G4E) ή της γλουταθειόνης (GGT6, RRM1), και καταστολή μορίων προσκόλλησης κυττάρων-ΕΘΟ (PECAM1, VCAM1). Ένα αξιοσημείωτο εύρημα ήταν η επαγωγή δεικτών εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων (EPHA1, SCNN1A) και γονιδίων που συμμετέχουν στον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό (SOX2, KLF4, OVOL1, IRF6, TACSTD2, CDH1) στην ΟΚΚ. Αυτά τα ευρήματα ήταν σε μεγάλο βαθμό κοινά μεταξύ των σποραδικών και των συνδρομικών ΟΚΚ, καθώς και μεταξύ πρωτοπαθών βλαβών και υποτροπών. Με τη μέθοδο της qPCR επιβεβαιώθηκε η επαγωγή των ALDH3A1, ATP12A, EPCAM, FETUB, GRHL3, OVOL1, SERPINB3, TACSTD2, και TP63, και με την ανοσοϊστοχημική μέθοδο χαρτογραφήθηκε η έκφραση των SOX2, KLF4, OVOL1, IRF6, TACSTD2/TROP2, CDH1/E-cadherin και p63, που εντοπίζονταν κυρίως στις υπερβασικές επιθηλιακές στιβάδες της ΟΚΚ. Επίσης, παρατηρήθηκε μεγάλος βαθμός επικάλυψης μεταξύ των ΔΕΓ της παρούσας μελέτης και της προηγούμενης μελέτης μικροσυστοιχιών (GSE38494) και εμπλουτισμός των γονιδιακών οντολογιών που σχετίζονται με την ανάπτυξη επιδερμίδας και τη διαφοροποίηση κερατινοκυττάρων μεταξύ των κοινών επαγόμενων γονιδίων. Η συστηματική ανασκόπηση συμπεριέλαβε 93 ανοσοϊστοχημικούς δείκτες από 71 μελέτες στην ποιοτική ανάλυση. Ο κίνδυνος μεροληψίας ήταν υψηλός σε 34 μελέτες, μέτριος σε 22, και χαμηλός σε 15. H έκφραση 29 δεικτών σε συνολικά 25 μελέτες διέφερε μεταξύ των δύο υποτύπων της ΟΚΚ, καθώς στις συνδρομικές ΟΚΚ παρατηρήθηκε μεγαλύτερος αριθμός θετικών στο δείκτη κυττάρων ή/και μεγαλύτερη ένταση χρώσης. Τα δεδομένα για 6 δείκτες (bcl-2, Cyclin D1, CD56, CK18, p53 και PCNA) από 11 μελέτες συμπεριλήφθηκαν στη μετα-ανάλυση, η οποία αποκάλυψε πως κανένας εξ αυτών δεν μπορούσε να διακρίνει τις συνδρομικές από τις σποραδικές ΟΚΚ, σε 95% διάστημα εμπιστοσύνης. Συμπεράσματα: Η παρούσα μελέτη επιβεβαιώνει την υπάρχουσα βιβλιογραφία σχετικά με τις δυνατότητες εφαρμογής της μεθόδου RNA-seq σε ιστούς μονιμοποιημένους στη φορμόλη και αποθηκευμένους στην παραφίνη έως 20 έτη. Η σποραδική (πρωτοπαθής βλάβη ή υποτροπή) και η συνδρομική ΟΚΚ χαρακτηρίζονται από κατά κανόνα κοινό πρόγραμμα γονιδιακής έκφρασης. Το μεταγράφωμα της ΟΚΚ διακρίνεται από αξιοσημείωτη επιδερμική διαφοροποίηση, με στοιχεία οδοντογενούς επιθηλιακής διαφοροποίησης και ενδείξεις περιορισμένης συμμετοχής του οδοντογενούς μεσεγχύματος, σημαντική αναδιαμόρφωση της ΕΘΟ, καθώς και υπερέκφραση δεικτών βλαστοκυττάρων. Επίσης, χαρακτηρίζεται από σημαντική επαγωγή οδών του μεταβολισμού, εύρημα που πιθανώς σχετίζεται με την τοπικά επιθετική βιολογική συμπεριφορά της, και από την καταστολή μορίων προσκόλλησης κυττάρων-ΕΘΟ, που συνάδει με την ιστοπαθολογικά παρατηρούμενη αποκόλληση του επιθηλίου από το κυστικό τοίχωμα. Πολυδύναμοι δείκτες βλαστοκυττάρων (SOX2, KLF4), γονίδια που συμμετέχουν στον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό (OVOL1, IRF6) ή επάγονται κατά τα αρχικά (CDH1/E-cadherin) ή τα ενδιάμεσα (TACSTD2/TROP2) στάδιά του, εκφράζονταν κυρίως στις υπερβασικές στιβάδες του επιθηλίου της ΟΚΚ. Τέλος, δεν υπάρχει δημοσιευμένος ανοσοϊστοχημικός δείκτης που να μπορεί να διακρίνει με ασφάλεια τη συνδρομική από τη σποραδική ΟΚΚ.