Development of an integrated biosensor system for Toxicology and Pharmacology applications

Abstract

This thesis presents an analytical study regarding electrical impedance measurements on various cell lines. Based on the principles of Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) as a technique mostly applied for biological assays, the electrical properties of the solution tested were evaluated. The characterization of complex resistance and its variations as a function of application field is described by impedance. A common approach in different medical areas is bio-impedance as a non-invasive and simultaneously cost-effective method. The application of different substances that considerably affect the cell culture confirmed the significance of this method. Moreover, impedance measurements provide important information about the culture’s properties tested under cells’ immobilization conditions. Specific custom-made electrodes were used for the evaluation of impedance measurements in combination with custom-made 3D printed well. The first experimental section presents the application of a particular catecholamine neurotransmitter. More specifically, dopamine (DA) was used as a stimulant to immobilized cell culture for the evaluation of the effects of this bioactive substance. The extraction of calibration curves in a specific frequency range with the application of known DA concentrations with the use of an impedance meter is the key aim of this section. The behaviour of immobilized and non-immobilized cells with the presence of the same DA concentrations as well as the behaviour of respective DA solutions without cells were assessed for comparison purposes. The results indicated that the electrical response of the cell medium is affected by the presence of frequency, thus the immobilization conditions can be considered as a crucial factor in cell cultures. In addition, the electrical response appeared to interfere with dopamine’s absorption from cells, information that can be taken into account for medical evaluation regarding schizophrenia, Parkinson’s disease, etc. In the second experimental section, the interactions of immobilized cells under either two-dimensional (2D) or three-dimensional (3D) conditions treated to a bioactive substance are evaluated. In particular, these two types of cell immobilization arrangements are able to mimic in vivo tissue conditions. The impedance analysis was implemented in murine neuroblastoma cells treated to a specific stimulant. From the results of the previous experimental section, DA was chosen once again as a bioactive substance for further investigation. The main objective of this section is again the extraction of calibration curves in various frequencies for the analytical description of the dopamine’s behaviour, this time applied to 2D and 3D immobilized cell cultures. For both immobilization matrices, the mean impedance value was assessed in every frequency tested. The differential responses highlighted the influence of the impedance when a frequency is applied for both immobilization cases and especially in the 2D immobilization matrix where the impedance has higher values. Moreover, the results showed that the increase in dopamine concentration is related to a decrease in impedance for the case of the 3D immobilization matrix, although the opposite behavior is noticed in the 2D case. The third and last experimental section is focused on anticancer drug research and assessment. In literature, scientists have pointed out the essential role of cancer cell lines as they can provide significant information from real-time impedance measurements, regarding cell viability. Four different adherent mammalian cancer cell lines (SK-N-SH, HeLa, HEK293, and MCF-7) immobilized in three-dimensional (3D) for three different populations (50.000, 100.000, and 200.000 cells/100μl) using calcium alginate hydrogel matrix conditions were formed in order to be evaluated by Electric Impedance Spectroscopy analysis. 5-fluorouracil (5-FU) was used as a standard cytostatic agent in every cell culture. This section aims to evaluate the behavior of the abovementioned cell lines after the application of 5-FU by extracting the mean impedance values in various frequencies. For comparison purposes, the same impedance measurements were carried out for pure immobilized cell cultures. The obtained results displayed a relation concerning the cell population for every cell line in conjunction with the frequency-dependent impedance. In addition, the impedance range can indicate the possibility to detect tumor cells along with the results of chemotherapy using impedance measurements. This can be explained by the ability of this method to differentiate the alterations among population densities and cell morphologies. The contribution of this research work to the field of pharmacology and toxicology is the development and the characterization of a biosensor system based on electrical impedance measurements. The proposed biosensor system constitutes a cost-effective and efficient solution for the implementation of impedance measurements on various cell lines. All experimental approaches indicated a sufficient device-response regarding the solution tested in conjunction with the impedance meter. Despite the fact that the meter used for each experiment allowed the selection of only five frequencies, the results from the mean impedance calculated using the magnitude values of each solution demonstrated a pattern able to discriminate the alterations of cells’ morphology with or without the presence of a bioactive substance. Thus, the proposed biosensor system is considered promising for future research concerning improvements on specific parameters such as the type of electrodes, the size of the well, etc.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή παρουσιάζει μια αναλυτική μελέτη σχετικά με τις ηλεκτρικές μετρήσεις σύνθετης αντίστασης (εμπέδησης) σε διάφορες κυτταρικές σειρές. Με βάση τις αρχές της Φασματοσκοπίας Ηλεκτροχημικής Εμπέδησης (EIS) ως μια τεχνική που εφαρμόζεται κυρίως για βιολογικές δοκιμές, αξιολογήθηκαν οι ηλεκτρικές ιδιότητες του διαλύματος προς δοκιμή. Ο χαρακτηρισμός της σύνθετης αντίστασης καθώς και οι παραλλαγές της ανά πεδίο εφαρμογής περιγράφονται από την εμπέδηση. Μια κοινή προσέγγιση για διαφορετικούς ιατρικούς τομείς αποτελεί η βιο-εμπέδηση ως μια μέθοδος μη επεμβατική και παράλληλα οικονομικά αποδοτική. Η εφαρμογή διάφορων ουσιών που επηρεάζουν σημαντικά τις κυτταροκαλλιέργειες επιβεβαιώνει την σημασία αυτής της μεθόδου. Επιπρόσθετα, οι μετρήσεις εμπέδησης παρέχουν σημαντικές πληροφορίες για τις ιδιότητες της καλλιέργειας που δοκιμάστηκαν υπό συνθήκες ακινητοποίησης των κυττάρων. Για την εκτέλεση των μετρήσεων εμπέδησης χρησιμοποιήθηκαν συγκεκριμένα ειδικά προσαρμοσμένα ηλεκτρόδια από διαφορετικά υλικά σε συνδυασμό με ειδικά κατασκευασμένη τρισδιάστατα εκτυπωμένη κοιλότητα. Η πρώτη πειραματική ενότητα παρουσιάζει την εφαρμογή ενός συγκεκριμένου νευροδιαβιβαστή κατεχολαμίνης. Πιο συγκεκριμένα, η ντοπαμίνη (DA) χρησιμοποιήθηκε ως διεγερτικό συστατικό στην ακινητοποιημένη κυτταρική καλλιέργεια για την αξιολόγηση των επιδράσεων της συγκεκριμένης βιοδραστικής ουσίας. Ο βασικός στόχος αυτής της ενότητας είναι η εξαγωγή των καμπυλών βαθμονόμησης για ένα συγκεκριμένο πεδίο συχνοτήτων με την εφαρμογή γνωστών συγκεντρώσεων ντοπαμίνης χρησιμοποιώντας μια συσκευή μέτρησης εμπέδησης. Για λόγους σύγκρισης, πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις που αφορούν την συμπεριφορά ακινητοποιημένων κυττάρων και μη με την παρουσία των ίδιων συγκεντρώσεων ντοπαμίνης καθώς επίσης και μετρήσεις που αφορούν την συμπεριφορά των αντίστοιχων διαλυμάτων ντοπαμίνης χωρίς την παρουσία κυττάρων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ηλεκτρική απόκριση του κυτταρικού μέσου εξαρτάται από την συχνότητα, θεωρώντας έτσι τις συνθήκες ακινητοποίησης ως κρίσιμο παράγοντα στις κυτταρικές καλλιέργειες. Επιπλέον, η ηλεκτρική απόκριση φαίνεται να επηρεάζεται από την απορρόφηση της ντοπαμίνης από τα κύτταρα, πληροφορία που πρέπει να ληφθεί υπόψιν για την ιατρική αξιολόγηση σχετικά με την σχιζοφρένεια, την νόσο του Πάρκινσον κτλ. Στην δεύτερη πειραματική ενότητα αξιολογούνται οι αντιδράσεις των ακινητοποιημένων κυττάρων υπό συνθήκες δύο διαστάσεων ή τριών διαστάσεων κατά την εφαρμογή μιας βιοδραστικής ουσίας. Συγκεκριμένα, οι δυο τύποι των κυτταρικών διατάξεων ακινητοποίησης είναι ικανοί να μιμούνται in vivo συνθήκες ιστού. Η ανάλυση της εμπέδησης διεξήχθη σε κύτταρα νευροβλαστώματος ποντικιού που υποβλήθηκαν σε ένα συγκεκριμένο διεγερτικό στοιχείο. Από τα αποτελέσματα της προηγούμενης πειραματικής ενότητας, η ντοπαμίνη επιλέχθηκε και πάλι ως βιοδραστική ουσία για περαιτέρω έρευνα. Ο κύριος στόχος αυτής της ενότητας είναι η εξαγωγή καμπυλών βαθμονόμησης για διάφορες συχνότητες για την αναλυτική περιγραφή της συμπεριφοράς της ντοπαμίνης, αυτή τη φορά κατά την εφαρμογή της σε δισδιάστατες και τρισδιάστατες ακινητοποιημένες κυτταρικές καλλιέργειες. Η μέση τιμή της εμπέδησης αξιολογήθηκε για κάθε συχνότητα και για τους δυο τύπους ακινητοποίησης. Οι διαφορικές αποκρίσεις απέδειξαν την επίδραση της εμπέδησης όταν εφαρμόζεται μια συχνότητα και για τις δυο μεθόδους ακινητοποίησης και ειδικά για την περίπτωση της δυσδιάστατης ακινητοποίησης όπου η εμπέδηση είχε υψηλότερες τιμές. Επιπροσθέτως, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αύξηση στην συγκέντρωση της ντοπαμίνης σχετίζεται με την μείωση στην εμπέδηση για την περίπτωση της τρισδιάστατης ακινητοποίησης των κυττάρων, παρόλο που η δυσδιάστατη ακινητοποίηση παρουσίασε την αντίθετη συμπεριφορά. Η τρίτη και τελευταία πειραματική ενότητα εστιάζεται στην έρευνα και την αξιολόγηση αντικαρκινικών φαρμάκων. Στην βιβλιογραφία, οι επιστήμονες έχουν επισημάνει τον ουσιαστικό ρόλο που παίζουν οι καρκινικές κυτταρικές σειρές καθώς παρέχουν σημαντικές πληροφορίες από τις μετρήσεις εμπέδησης σε πραγματικό χρόνο σχετικά με την βιωσιμότητα των κυττάρων. Τέσσερις διαφορετικές προσκολλημένες καρκινικές κυτταρικές σειρές θηλαστικών (SK-N-SH, HeLa, HEK293, and MCF-7) που ακινητοποιήθηκαν τρισδιάστατα σε τρεις διαφορετικούς πληθυσμούς (50.000, 100.000, and 200.000 cells/100μl) χρησιμοποιώντας υδρογέλη αλγινικού ασβεστίου εξετάστηκαν μέσω φασματοσκοπίας ηλεκτροχημικής εμπέδησης. Η ουσία 5-φθοροουρακίλη (5-FU) χρησιμοποιήθηκε ως βασικός κυτταροστατικός παράγοντας σε κάθε κυτταρική καλλιέργεια. Η ενότητα αυτή στοχεύει στην αξιολόγηση της συμπεριφοράς των προαναφερθεισών κυτταρικών σειρών μετά την εφαρμογή του 5-FU εξάγοντας τις τιμές μέσης εμπέδησης για διαφορετικές συχνότητες. Για λόγους σύγκρισης, οι ίδιες μετρήσεις εμπέδησης διεξήχθησαν για καθαρές ακινητοποιημένες κυτταρικές καλλιέργειες. Τα αποτελέσματα που λήφθηκαν καταδεικνύουν μια σχέση ανάλογα με τον κυτταρικό πληθυσμό μεταξύ κάθε κυτταρικής σειράς και της αντίστασης που εξαρτάται από την συχνότητα. Επίσης, το εύρος της εμπέδησης μπορεί να υποδεικνύει την δυνατότητα ανίχνευσης καρκινικών κυττάρων μαζί με τα αποτελέσματα της χημειοθεραπείας χρησιμοποιώντας μετρήσεις εμπέδησης. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί λόγω της ικανότητας της μεθόδου να διαφοροποιεί τις μεταβολές μεταξύ της πυκνότητας του πληθυσμού και των μορφολογιών των κυττάρων. Η συμβολή της παρούσας ερευνητικής μελέτης περιλαμβάνει την ανάπτυξη καθώς επίσης και τον χαρακτηρισμό ενός συστήματος βιοαισθητήρα που βασίζεται σε μετρήσεις ηλεκτρικής αντίστασης στον τομέα της φαρμακολογίας και της τοξικολογίας. Το προτεινόμενο σύστημα βιοαισθητήρα αποτελεί μια οικονομική, αποδοτική και αποτελεσματική λύση για την εκτέλεση μετρήσεων εμπέδησης σε διάφορες κυτταρικές σειρές. Όλες οι πειραματικές προσεγγίσεις παρουσίασαν μια επαρκή απόκριση του βιοαισθητήρα σχετικά με το διάλυμα που δοκιμάστηκε σε συνδυασμό με την συσκευή μέτρησης της εμπέδησης. Παρόλο που η συσκευή που χρησιμοποιήθηκε για κάθε πείραμα επιτρέπει την επιλογή πέντε μόνο συχνοτήτων, τα αποτελέσματα της μέσης τιμής της εμπέδησης που υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τις τιμές του πλάτους για κάθε διάλυμα παρουσίασαν ένα μοτίβο ικανό να διακρίνει τις μεταβολές στην μορφολογία των κυττάρων με ή χωρίς την παρουσία βιοδραστικής ουσίας όταν εφαρμόζεται συχνότητα. Συνεπώς, το προτεινόμενο σύστημα βιοαισθητήρα θεωρείται πολλά υποσχόμενο για μελλοντική έρευνα μετά την εφαρμογή βελτιώσεων που αφορούν παράγοντες όπως ο τύπος των ηλεκτροδίων, το μέγεθος της κοιλότητας κτλ.