Μελέτη του ρόλου της L-Καρνιτίνης στην παθογένεια της ενδομητρίωσης

Abstract

Although endometriosis establishment and progression is yet not clear, it is generally accepted that the disease arises from the implantation and growth of ectopic endometrial tissue into the peritoneal cavity following retrograde menstruation. Immune alterations include increased number and activation of peritoneal macrophages, decreased T-cell cytotoxicity and increased circulating antibodies. Furthermore, compounds like cytokines and growth factors, as well as other mitogens in the environment of the abdominal cavity are thought to contribute to the development and progression of endometriosis. L-carnitine is an essential substance that is implicated in the process of lipid and carbohydrate metabolism. The present study examined whether administration of L-carnitine to young female mice alters the percentage of immune cells in peritoneal exudates and the uterus as well as the levels of IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-6, VEGF, GMCSF and IGF-1 in blood serum, peritoneal fluid and supernatants of uterine cultured cells as tested by immunofluorescence or ELISA techniques, respectively, leading to a pathological disorder resembling human endometriosis. The results showed that, except from infertility, L-carnitine treatment resulted in a significant increase of macrophages and to a lesser degree an increase of T-cells, while elevated levels of IFN-γ and TNF-α were detected in both serum and peritoneal fluid compared to controls. Although the levels of acyl-L-carnitine measured in mouse serum samples were increased, acyl-L-carnitine was decreased in the murine peritoneal fluid samples In order to evaluate whether L-carnitine may aggravate an already established state of endometriosis, an experimental model of the disease was established. Such model was achieved by the peritoneal administration of human endometrium cells from the Ishikawa cell line to young female mice. Immunohistochemical assays defined the sites of endometrial cell implantation detected by HLA-ABC monoclonal antibody as well as the invasiveness of CD90, CD11 positive cells. Simultaneous administration of L-carnitine demonstrated that, compared to mice that received solely human endometrial cells, L-carnitine increased the number of T-lymphocytes and macrophages, as well as the levels of IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-6, GM-CSF and VEGF, a phenomenon that lasted more than 60 days after Ishikawa cell administration, indicating thus a chronic inflammatory situation. The elevated levels of L-carnitine in the peritoneal fluid and not in the serum showed that L-carnitine is probably used by peritoneal cells. These results extended our previous findings indicating that L-carnitine can not only lead to endometriosis establishment but can also aggravate an already established endometriotic state to the female organism. To conclude, the findings analyzed above are relevant to human endometriosis and indicate that exogenous L-carnitine may play a role in the pathophysiology of endometriosis.

Αν και η παθογένεια της ενδομητρίωσης δεν είναι ακόμα σαφής, γενικά γίνεται αποδεκτό ότι η ασθένεια προκύπτει από την εμφύτευση και την αύξηση του εκτοπικού ενδομήτριου ιστού στην περιτοναϊκή κοιλότητα μετά από την οπισθοδρομική εμμηνόρροια. Παράλληλα οι ανοσoλογικές αλλαγές περιλαμβάνουν τον αυξανόμενο αριθμό και την ενεργοποίηση των περιτοναϊκών μακρόφαγων, μειωμένη κυτταροτοξικότητα των Τ-λεμφοκυττάρων και αυξανόμενα κυκλοφορούντα αντισώματα. Επιπλέον, μόρια όπως κυτοκίνες και παράγοντες αύξησης, αλλά και κάποια μιτογόνα στο περιβάλλον της κοιλιακής κοιλότητας θεωρούνται ότι συμβάλουν στην ανάπτυξη και την πρόοδο της ενδομητρίωσης. Η L-καρνιτίνη είναι μια ουσία που εμπλέκεται στον μεταβολισμό λιπιδίων και υδατανθράκων. Η L-καρνιτίνη είναι ο υποχρεωτικός μεταφορέας των μακριών και λιπαρών οξέων μεσαίων-αλυσίδων από το κυτταρόπλασμα στα μιτοχόνδρια μέσα από το μονοπάτι της β-οξείδωσης. Με τη ρύθμιση του μεταβολισμού των υδατανθράκων, η L-καρνιτίνη συμβάλει στη συντήρηση της δομής και της βιωσιμότητας των κυττάρων και έχει αναφερθεί ότι μειώνει τα αποπτωτικά επίπεδα των CD4+ και CD8 + κυττάρων. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε εάν η χορήγηση της L-καρνιτίνης σε νεαρά θηλυκά ποντίκια αλλάζει το ποσοστό των ανοσολογικών κυττάρων στο περιτοναϊκό υγρό και τη μήτρα καθώς επίσης και τα επίπεδα των κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων IFN-γ, TNF-α, IL-2, -4, -6, VEGF, GM-CSF και IGF-1 στον ορό αίματος, στο περιτοναϊκό υγρό και στα υπερκείμενα των καλλιεργημένων κυττάρων μήτρας από τα ποντίκια με και χωρίς χορήγηση L-καρνιτίνης, όπως εξετάζεται με ανοσοφθορισμό ή την τεχνική ELISA, αντίστοιχα, οδηγώντας έτσι σε μια παθολογική διαταραχή που μοιάζει με την ανθρώπινη ενδομητρίωση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, εκτός από τη στειρότητα, η χορήγηση της L-καρνιτίνης προκαλεί μια σημαντική αύξηση των μακρόφαγων και μια μικρότερου βαθμού αύξηση των Τ-λεμφοκυττάρων, ενώ υψηλά επίπεδα IFN-γ και TNF-α ανιχνεύθηκαν και στον ορό και στο περιτοναϊκό υγρό έναντι των δειγμάτων ελέγχου. Αν και τα επίπεδα L-καρνιτίνης που μετρήθηκαν στα δείγματα ορών ποντικιών χρησιμοποιώντας μια ραδιοσοτοπική μέθοδο παρουσίασαν μια αύξηση σε σύγκριση με αυτά των φυσιολογικών δειγμάτων, τα επίπεδα της ακύλ-L-καρνιτίνης που μετρήθηκαν στα ποντικίσια περιτοναϊκά υγρά παρουσίασαν μια μείωση παρόμοια με αυτήν που μετρήθηκε στα περιτοναϊκά υγρά ασθενών με ενδομητρίωση στο στάδιο IV της ασθένειας. Μετά από το συμπέρασμα ότι η L-καρνιτίνη αλλάζει το κυτταρικό και κυτταροκινικό προφίλ της μήτρας και του περιτοναϊκού υγρού στα ποντίκια κατόπιν in vitro ή in vivo χορήγησή της, εξετάσαμε εάν η L-καρνιτίνη μπορεί να επιβαρύνει μια ήδη υπάρχουσα κατάσταση ενδομητρίωσης. Η δημιουργία ενός πειραματικού μοντέλου της ασθένειας επιτεύχθηκε με την ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση κυττάρων ενδομητρίου από την Ishikawa κυτταρική σειρά σε νεαρά θηλυκά ποντίκια. Ανοσοϊστοχημικές χρώσεις καθόρισαν τις περιοχές της ενδομήτριας εμφύτευσης κυττάρων που ανιχνεύθηκαν με το HLA-ABC μονοκλωνικό αντίσωμα καθώς επίσης και της ενδομήτριας εξάπλωσης των CD90, CD11 θετικών κυττάρων. Η σύγχρονη χορήγηση L-καρνιτίνης έδειξε ότι, σε σχέση με τα ποντίκια που έλαβαν απλώς τα ανθρώπινα ενδομήτρια κύτταρα, η L-καρνιτίνη αύξησε τον αριθμό των Τ-λεμφοκυττάρων και των μακρόφαγων όπως και τα επίπεδα όλων των κυτταροκινών IFN-γ, TNF-α, IL-2, GM-CSF και VEGF, φαινόμενο που διάρκεσε τουλάχιστο για 60 ημέρες μετά τη χορήγηση των Ishikawa κυττάρων και δείχνει μια χρόνια κατάσταση φλεγμονώδους αντίδρασης. Τα αυξημένα επίπεδα της ακυλιωμένης L-καρνιτίνης στο περιτοναϊκό υγρό και όχι στον ορό δείχνουν ότι η L-καρνιτίνη χρησιμοποιείται πιθανώς από τα κύτταρα στην περιτοναϊκή κοιλότητα. Αυτά τα αποτελέσματα επεκτείνουν τα προηγούμενα συμπεράσματά μας και δείχνουν ότι ενώ η L-καρνιτίνη μπορεί να συμβάλλει στη εγκαθίδρυση μιας παθολογικής κατάστασης ενδομητρίωσης, μπορεί επίσης να επιβαρύνει μια ήδη υπάρχουσα κατάσταση ενδομητρίωσης στο θηλυκό οργανισμό. Συμπερασματικά, ότι αναλύεται ανωτέρω είναι σχετικό με την ανθρώπινη ενδομητρίωση και δείχνει ότι η εξωγενής L-καρνιτίνη μπορεί να διαδραματίσει έναν ρόλο στην παθοφυσιολογία της ενδομητρίωσης.