Ανάλυση του μικροβιώματος σιέλου σε ασθενείς με μη αντιρροπούμενη κίρρωση ήπατος

Abstract

INTRODUCTION: Cirrhosis is an increasing cause of morbidity and mortality worldwide. Understanding of the natural history of cirrhosis and the pathophysiology of disease progression, could help improve patients’ management. At least for the last decade, it is reported that gut flora contributes to the pathogenesis of cirrhosis’ complications. Microbiome analysis in stool samples confirmed the existence of dysbiosis in the gut of patients with cirrhosis. Recently, microbiome dysbiosis was found even in salivary samples of cirrhotic patients with hepatic encephalopathy and cirrhotic patients with hepatocellular carcinoma. There are data supporting the role of oral-gut-liver axis in the pathogenesis of cirrhosis, suggesting a massive invasion of the gut by oral bacterial species from the mouth, responsible for the change of gut microbiota seen in cirrhosis. AIM: To analyze microbiome in salivary samples of patients with stable decompensated cirrhosis. We included patients of various etiology and history of complications, regarding their hepatic disease progression. We even performed comparison with healthy controls’ salivary samples. MATERIALS & METHODS: We included 28 patients with stable decompensated cirrhosis and 26 matched healthy-controls. In our cohort there were five patients (17.8%) diagnosed with hepatocellular carcinoma. We excluded patients and controls with infections, dental diseases, those under antibiotics, probiotics, or corticosteroids within 12 weeks before enrolment, or those who had a history of alcohol consumption. For every participant a salivary sample was collected. There were 54 salivary samples that were profiled through next-generation sequencing of 16S-rRNA region in bacteria in order to define salivary microbiomes. RESULTS: The two groups (patients and controls) did not differ significantly regarding their baseline characteristics. The most abundant phyla were Firmicutes (38.43%), Bacteroidetes (29.88%), Proteobacteria (21.17%), Fusobacteria (4.73%). Proposed dysbiosis ratio Firmicutes/Bacteroidetes was lower in patients than in controls (range: 0.05-2.54 vs 0.28-2.18, p=0.4), showing no statistical significance. Phylum Deinococcus-Thermus detected only in controls, while Phylum Planctomycetes detected only in patients. A-diversity analysis indicated low diversity of salivary microbiome in decompensated patients, as well as in patients with HCC, who presented specific discriminative taxa. On principal coordinate analysis (PCoA) patients’ and controls’ salivary microbiomes clustered apart suggesting differences in community composition [Permutational Multivariate Analysis of Variance (PERMANOVA) test, p=0.008]. Boruta wrapper algorithm selected the most representative genera able to classify controls and patients (ROC analysis- AUC= 0.815). CONCLUSIONS: Patients with stable decompensated cirrhosis of various etiology and history of complications, have decreased diversity of salivary microbiome. PCoA and Boruta algorithm may represent useful tools to discriminate salivary microbiome in patients with decompensation. Our findings added to the existing knowledge regarding dysbiosis in cirrhosis found even in oral cavity, which is more accessible compared to gut making salivary sampling easier over fecal. Finally we outlined the utility of salivary microbiome analysis in decompensated cirrhosis given its therapeutic and diagnostic implications.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Η κίρρωση ήπατος αποτελεί αυξανόμενη αιτία νοσηρότητας και θνητότητας παγκοσμίως. Η κατανόηση της παθογένεσης των επιπλοκών θα συμβάλλει στην ορθότερη διαχείριση των ασθενών. Τουλάχιστον την τελευταία δεκαετία είναι γνωστή η συμβολή του εντερικού μικροβιώματος στην εξέλιξη των ηπατικών νοσημάτων. Αναλύσεις του μικροβιώματος σε δείγματα κοπράνων επιβεβαίωσαν την ύπαρξη αλλαγών που χαρακτηρίζουν το δυσβιοτικό μικροβίωμα των ασθενών με κίρρωση. Νεότερα δεδομένα ανέδειξαν τέτοιες αλλαγές και στο μικροβίωμα σιέλου ασθενών με επιπλοκές της κίρρωσης καθώς και σε ασθενείς με ηπατοκυτταρικό καρκίνο (ΗΚΚ). Σύμφωνα με τη θεωρία του άξονα στοματικής κοιλότητας- εντέρου- ήπατος, η αλλαγή του εντερικού μικροβιώματος οφείλεται στην εισβολή μικροβίων από τη στοματική κοιλότητα. ΣΚΟΠΟΣ: Η μελέτη ασθενών με μη αντιρροπούμενη κίρρωση, κάθε αιτιολογίας και με κάθε πιθανή επιπλοκή της νόσου για ανάλυση του μικροβιώματός τους σε δείγματα σιέλου. Ακόμη επιδιώξαμε σύγκριση με βάση υγιείς εθελοντές τους οποίους εξομοιώσαμε με τους ασθενείς. ΥΛΙΚΟ-ΜΕΘΟΔΟΙ: Συμπεριλάβαμε 28 ασθενείς με σταθερή μη αντιρροπούμενη κίρρωση ήπατος, που εξομοιώθηκαν με 26 υγιείς-μάρτυρες. Μεταξύ των ασθενών υπήρχαν πέντε (17.8%) που εμφάνισαν ΗΚΚ. Για τους ασθενείς και τους μάρτυρες εφαρμόστηκαν κριτήρια ένταξης και αποκλεισμού, κυρίως απουσία ενεργού λοίμωξης, μη χρήση αντιβιοτικών/ κορτικοστεροειδών το τελευταίο 3μηνο, αποχή από το αλκοόλ και οι οδοντικές παθήσεις. Σε κάθε έναν από τους συμμετέχοντες ελήφθη δείγμα σιέλου. Συλλέχθηκαν 54 δείγματα στα οποία εφαρμόστηκε αλληλούχιση γονιδιώματος με τεχνολογία next-generation sequencing και ανάγνωση της 16S-rRNA περιοχής των βακτηρίων, προς προσδιορισμό του μικροβιώματος σιέλου. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Η ομάδα των ασθενών και των μαρτύρων δεν διέφερε σημαντικά ως προς τα βασικά χαρακτηριστικά. Τα μικρόβια με τις μεγαλύτερες αφθονίες σε επίπεδο φύλου ήταν τα Firmicutes (38.43%), Bacteroidetes (29.88%), Proteobacteria (21.17%), Fusobacteria (4.73%). Υπολογίσαμε τον προτεινόμενο δείκτη δυσβίωσης Firmicutes/Bacteroidetes: βρέθηκε χαμηλότερος στους ασθενείς σε σχέση με τους μάρτυρες (εύρος τιμών: 0.05-2.54 vs 0.28-2.18, p=0.4), χωρίς στατιστικά σημαντική διαφορά ωστόσο. Το φύλο Deinococcus-Thermus βρέθηκε μόνο στα δείγματα των μαρτύρων, ενώ το φύλο Planctomycetes μόνο στους ασθενείς. Στην ανάλυση a-diversity διαπιστώθηκε χαμηλή ποικιλομορφία του μικροβιώματος σιέλου των ασθενών μας, όπως επίσης και στην ομάδα των ασθενών με ΗΚΚ. Στην ανάλυση PCoA (principal coordinate analysis) οι μικροβιακές κοινότητες των ασθενών και των μαρτύρων διαχωρίζονταν και συσπειρώνονταν μεταξύ τους, υποδηλώνοντας την ύπαρξη διαφορών στη σύνθεση του μικροβιώματος, όπως επιβεβαιώθηκε με στατιστική σημαντικότητα στη δοκιμασία PERMANOVA (Permutational Multivariate Analysis of Variance), p=0.008. Ακόμη εφαρμόστηκε ο διαγνωστικός αλγόριθμος Boruta με τον οποίο έγινε επιλογή των πιο αντιπροσωπευτικών μικροβίων σε επίπεδο γένους και επιτεύχθηκε ταξινόμηση των ασθενών και των μαρτύρων με βάση το μικροβίωμα τους, ανάλυση ROC- AUC= 0.815. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Οι ασθενείς με σταθερή μη αντιρροπούμενη κίρρωση ήπατος, οποιασδήποτε αιτιολογίας και ιστορικού ρήξης αντιρρόπησης έχουν μειωμένη βακτηριακή ποικιλομορφία και διακριτό μικροβίωμα σε δείγματα σιέλου. Αναδείξαμε την ανάλυση PCoA και τον αλγόριθμο Boruta ως σημαντικά εργαλεία για τη διάκριση των ασθενών έναντι των υγιών μαρτύρων, με βάση το μικροβίωμά τους. Τα ευρήματα της μελέτης μας συμπληρώνουν τη γνώση για το δυσβιοτικό μικροβίωμα στην παθογένεια της κίρρωσης και μάλιστα σε δείγματα σιέλου που είναι πιο εύκολα προσβάσιμο και εύχρηστο. Αναδείξαμε επομένως τη χρησιμότητα της μελέτης του μικροβιώματος σιέλου στην μη αντιρροπούμενη κίρρωση ήπατος, υπονοώντας θεραπευτικές και διαγνωστικές προεκτάσεις.