DNA damage response and repair network in systemic autoimmune diseases

Abstract

The human genome confronts thousands of DNA lesions every day, that arise either via DNA replication or endogenous and/or exogenous insults. DNA damage response and repair (DDR/R) network is a hierarchically structured network, that recognizes any DNA lesion and assigns the proper repair process. The accumulation of DNA damage has a negative impact in cell function and homeostasis; if DNA lesions are left unprepared, the cell passes its mutated genome to offspring or undergoes apoptosisor senescence. Recent studies demonstrate that aberrant DDR/R network is implicated in the pathogenesis and perpetuation of systemic autoimmune diseases, among them Rheumatoid Arthritis (RA), Systemic Lupus Erythematosus (SLE) and Systemic Sclerosis (SSc). There is mounting evidence suggesting that DDR/R and Immune Response (ImmR) network work together as a cellular protective mechanism against endogenous or exogenous threats. Based upon these data, we investigated the interplay between DDR/R and ImmR network and how molecular changes in the DDR/R network can affect immune response and contribute in the pathogenesis of systemic autoimmunity.Overall, 20 RA patients, 20 SLE, 37 SSc and 55 controls were enrolled and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated. Endogenous DNA damage levels were assessed using single-cell gel electrophoresis. Repairing capacity of Nucleotide Excision Repair (NER) was assessed with two different ways: first, freshly isolated PBMCs were treated with melphalan ex vivo and second, NER efficiency was assessed after irradiation with UVC. Double strand break repair (DSB/R) efficacy was examined in PBMCs with immunofluorescence antigen staining and confocal laser scanning microscopy. Chromatin organization and expression of critical DNA repair associated genes were also examined. Finally, type I interferon induced genes expression was also quantified by qRT- PCR.Higher levels of endogenous DNA damage were present in patients compared to HC [Olive Tail Moment (OTM) units (mean ± SD): HC: 4.5 ±2.3, RA: 11.8 ± 6.9, SLE: 8.2 ± 4.5]. Endogenous DNA damage was significantly higher in untreated patients with diffuse (14.7 ± 7.0) and limited SSc (9.5 ± 4.1) and in patients treated with cyclophosphamide (15.0 ± 5.4), but not in VEDOSS patients (5.6 ± 1.2). HC and patients show similar repair capacity and similar DNA damage accumulation in the transcribed strand of the active FN6 fragment of the N-ras gene, indicating that TC-NER is preserved in patients, whereas, the repair efficiency of the non-transcribed strand (repaired by GG-NER, p< .001) differs, with patients showing significantly lower repair capacity and increased DNA damage accumulation. In patients, impaired DSB/R mechanism is noticed; γH2AX foci reached maximal levels within 8 hours, thereafter, their levels were decreased, with the removal capacity being faster in healthy controls than in patients. Patients exhibit more condensed chromatin structure than HC. Moreover, genes involved in DSB/R and Base Excision Repair (BER) are downregulated in SSc patients versus BAX and BBC3 (apoptosis-related genes) which are unregulated, compared with HC. Individual levels of DNA damage on SSc PBMCs correlated with corresponding mRNA expression of type I interferon induced genes (IFIT1, IFI44, MX1, all p< .05).In conclusion, we demonstrated that deregulated DDR/R network is present in patients with systemic autoimmune diseases, may be associated with increased type I IFN signature and contribute to the pathogenesis of these diseases.

Το ανθρώπινο γονιδίωμα αντιμετωπίζει καθημερινά μερικές χιλιάδες DNA βλάβες, είτε εξαιτίας “λαθών” κατά την αντιγραφή είτε εξαιτίας ενδογενών (ελεύθερες ρίζες οξυγόνου) ή/και εξωγενών “απειλών”, όπως η ιονίζουσα και η υπεριώδης ακτινοβολία ή μεταλλαξιογόνοι παράγοντες και χημειοθεραπευτικές ουσίες, που απειλούν την ακεραιότητά του. Το κυτταρικό δίκτυο απόκρισης και επιδιόρθωσης της βλάβης του DNA (DNA damage response and repair System, DDR/R) αποτελεί ένα δίκτυο ιεραρχικά δομημένων μονοπατιών σηματοδότησης, που ενεργοποιείται με την ανίχνευση βλάβης του DNA και ακολουθείται από μια διαδικασία μεταγωγής σήματος η οποία, στο τελικό βήμα, ενεργοποιεί μηχανισμούς προστασίας του γονιδιώματος. Η αδυναμία επιδιόρθωσης των συσσωρευμένων βλαβών οδηγεί το κύτταρο, είτε σε δημιουργία μεταλλάξεων, είτε σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (απόπτωση) ή γήρανση. Σε αυτή την περίπτωση τα αποπτωτικά κύτταρα απομακρύνονται μέσω του συστήματος των μονοπύρηνων μακροφάγων, διατηρώντας την ομοιοστασία των ιστών. Ελαττωματικοί μηχανισμοί επιδιόρθωσης του DNA έχουν αναφερθεί σε αυτοάνοσα νοσήματα, όπως ο ΣΕΛ. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι λεμφοκύτταρα και ουδετερόφιλα από ασθενείς με ΣΕΛ εμφανίζουν συσσώρευση βλαβών του DNA και ελαττωματική επιδιόρθωσητωνοξειδωτικώνβλαβώντουDNA. Πρόσφατες δημοσιεύσεις αναφέρουν συσχετισμό της ικανότητας επιδιόρθωσης των βλαβών του DNA με την ενεργοποίηση του συστήματος ανοσιακής απόκρισης μέσω της επαγωγής της ιντερφερόνης (IFN) τύπου Ι. Με βάση τα παραπάνω δεδομένα θα διερευνηθεί η υπόθεση εάν μοριακές αλλαγές στο δίκτυο DDR/R έχουν τη δυνατότητα να απορυθμίζουν το σύστημα της ανοσολογικής απόκρισης, συμβάλλοντας έτσι στην παθογένεια των συστηματικών αυτοάνοσων νοσημάτων. Συνολικά, 20 ασθενείς με Ρευματοειδή Αρθρίτιδα (ΡΑ), 20 με Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο (SLE), 37 Συστηματικό Σκληρόδερμα (SSc) και 55 υγιείς μάρτυρες (HC) έλαβαν μέρος στη μελέτη, από τους οποίους απομονώθηκαν λεμφομονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs). Η ενδογενής βλάβη του DNA μελετήθηκε με ηλεκτροφόρηση μοναδιαίων κυττάρων (single-cell gel electrophoresis). H επιδιορθωτικά ικανότητα του NER εξετάστηκε με δύο μεθόδους: αρχικά, έγινε ex vivo επίδραση στα PBMCs με μελφαλάνη και μελετήθηκε η επιδιορθωτική ικανότητα των δύο υπομηχανισμών του NER στο N-rasγονίδιο (FN6 fragment). Επιπλέον, o NER μελετήθηκε ύστερα από ex vivo ακτινοβόληση των PBMCs. Ο μηχανισμός επιδιόρθωσης δίκλωνων DNA θραυσμάτων (DSB/R) μελετήθηκε με συνεστιακή μικροσκοπία για τη μέτρηση της ιστόνης γΗ2ΑΧ με ανοσοφθορισμό. Επίσης, εξετάστηκε ο βαθμός συμπύκωνσης της χρωματίνης και η έκφραση γονιδίων εμπλεκόμενων στο DDR/R και την επαγωγή της ιντερφερόνης Ι.Οι ασθενείς με συστηματικά αυτοάνοσα νοσήματα έχουν υψηλότερα επίπεδα βλάβης DNA συγκριτικά με υγιείς: [Olive Tail Moment (OTM) units (mean ± SD): HC: 4.5 ±2.3, RA: 11.8 ± 6.9, SLE: 8.2 ± 4.5]. Οι ασθενείς με διάχυτο σκληρόδερμα που έχουν λάβει θεραπεία(15.0 ± 5.4) και οι ασθενείς με περιορισμένο(9.5 ± 4.1) και διάχυτο σκληρόδερμα που δεν έχουν λάβει θεραπεία(14.7 ± 7.0)έχουν υψηλότερη ενδογενή βλάβη σε σχέση με υγιείς και ασθενείς με VEDOSS (5.6 ± 1.2). Οι ασθενείς εμφάνισαν παρόμοια ικανότητα επιδιόρθωσης της μεταγραφόμενης αλυσίδας του δραστικού γονιδίου N-ras (επιδιορθώνεται από TC-NER) συγκριτικά με HC, αλλά μικρότερη ικανότητα επιδιόρθωσης της μη-μεταγραφόμενης αλυσίδας του N-ras και των δύο αλυσίδων περιοχών εκτός γονιδίου (επιδιορθώνονται από GG-NER, p< .001). Επιπλέον, οι SScασθενείς έδειξαν χαμηλότερη επιδιορθωτικά ικανότητα των DSBs, με αποτέλεσμα υψηλότερη συσσώρευση βλάβης στο DNA (εκφράζεται ως AUC) συγκριτικά με HC (p< .001). Η επιδιορθωτικά ικανότητα του GG-NER σχετίζεται αντίστροφα με το βαθμό συμπύκνωσης της χρωματίνης, με τους ασθενείς να εμφανίζουν περισσότερο συμπυκνωμένη δομή. Τα γονίδια που εμπλέκονται στον DSB/R και τον Base Excision Repair (BER) υποεκφράζονται, ενώ τα γονίδια BAX και BBC3 (σχετιζόμενα με την απόπτωση) υπερκεφράζονται στους SScασθενείς, συγκριτικά με τους υγιείς. Τα επίπεδα ενδογενούς DNA βλάβης στους ασθενείς με SSc, συσχετίζονται με την έκφραση των γονιδίων που επάγονται από την ιντερφερόνη τύπου Ι (IFIT1, IFI44, MX1, all p< .05).Συμπερασματικά, οι ασθενείς με συστηματικά αυτοάνοσα νοσήματα εμφανίζουν διαταραχή στο δίκτυο DDR/R, που συνδέεται με επιγενετικές τροποποιήσεις και αλλαγή στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την ιντερφερόνη, και αυτά συντελούν, εν μέρει, στην παθογένεια και διαιώνιση των αυτοάνοσων νοσημάτων.