Biological response of human cancer cells to ionizing radiation in combination with gold nanoparticles

Abstract

The interaction of ionizing radiation (IR) with the biological matter is a phenomenon that its full understanding will help to elucidate radiation-related carcinogenic mechanisms and to more effectively treat cancer through radiotherapy. In recent medicine, nanotechnology and specifically nanoparticles are some of the indispensable tools in disease monitoring and therapy. A growing interest in the improvement of radiation therapies has led to the development of gold-based nanomaterials as radiation enhancers/radiosensitizers. Gold nanoparticles (AuNPs) have demonstrated strong potential as radiosensitizers among other uses, due to their biocompatibility and the high atomic number (Z) of gold, which give it a significantly high X-ray mass energy absorption coefficient compared to soft tissue. The radiosensitizing effect of gold nanoparticles is attributed to a dose enhancement mechanism through the production of secondary electrons after exposure to ionizing radiation, especially low linear energy transfer (low-LET) radiation in the kilovoltage photon energy range. However, it is now clear that there is also a plethora of chemical and biological factors involved in this action. It is important to distinguish between dose enhancement–that is, the increase in energy deposited in the target volume due to the presence of the nanoparticles –and radiosensitization, the increase in the biological effects of radiation observed when used in combination with nanoparticles. During radiation therapy, healthy tissue surrounding the cancerous region is usually affected by the treatment. The accumulation of AuNPs in tumor sites can lead to a local dose enhancement, even with low radiation doses, while at the same time minimizing the risk for the surrounding healthy tissue. The main purpose of this thesis is to study the biological responses of multiple human cancer cells to ionizing radiation in combination with gold nanoparticles by evaluating multiple factors, some of which have not yet been investigated in this research field. The combination of IR with AuNPs may increase the clustering of energy deposition events in the vicinity of the nanoparticles leading to multiple adverse biological effects. These biological effects refer to cellular damage and include DNA damage and/or DNA repair inhibition, cell cycle effects, cell death, or cellular senescence. Biological lesions of such origin for example on DNA are more difficult to be repaired compared to isolated lesions and can augment IR’s detrimental effects by inducing simultaneously multiple DNA lesions such as base lesions, single strand breaks (SSBs) and double strand breaks (DSBs) otherwise known as complex DNA damage. Focus has been given here into identifying these effects comprehensively on a cellular level by employing many methodologies such as transmission electron microscopy, immunofluorescence, flow cytometry, cytogenetics, clonogenic survival assays and other immunocytochemical methods. The use of electron microscopy aims in the investigation of the cellular uptake and localization of AuNPs, but it also constitutes a key tool in investigating for the first time DNA damage after AuNP-induced radiosensitization, giving valuable insights into the complexity of these formed lesions. The detection of complex DNA damage is pursued using multiple elaborate techniques. Here, immunocytochemical techniques are employed by immunofluorescence and electron microscopy to visualize DNA damage, by detecting simultaneously or separately DSB repair proteins such as γH2AX or base lesion repair proteins such as OGG1. Ionizing radiation results in a mixture of cellular outcomes including cell death and senescence. The possible induction of senescence caused by oxidative stress or DNA damage after radiosensitization with AuNPs, has not been yet investigated. For this purpose, cell survival as well as cellular senescence is evaluated through clonogenic survival assays and detection of senescent markers, respectively. In the framework of the present thesis and in combination to the unique role of AuNPs, the DNA repair inhibitor Talazoparib is also tested in order to investigate the synergistic radiosensitizing effects of this multimodal approach. Summarizing, results presented here point to the important role of gold nanoparticles as radiosensitizers in cancer therapy, by considering however the possible restrictions. This comprehensive study aims to elucidate all the details underpinning the radiosensitizing effects of AuNPs and introduce new techniques and methodologies that need to be implemented in order to be able in the future to provide a nanoparticle-boosted radiation therapy.

Η αλληλεπίδραση της ιοντίζουσας ακτινοβολίας (IΑ) με τη βιολογική ύλη είναι ένα φαινόμενο που η πλήρης κατανόησή του θα βοηθήσει στην αποσαφήνιση των καρκινογόνων μηχανισμών που σχετίζονται με την ακτινοβολία καθώς και στην αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση του καρκίνου μέσω της ακτινοθεραπείας. Στην σύγχρονη ιατρική, η νανοτεχνολογία και συγκεκριμένα τα νανοσωματίδια αποτελούν μερικά από τα απαραίτητα εργαλεία για την παρακολούθηση και τη θεραπεία ασθενειών. Το αυξανόμενο ενδιαφέρον με στόχο τη βελτίωση της ακτινοθεραπείας έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη νανοϋλικών με βάση τον χρυσό ως παράγοντες ενίσχυσης δόσης της ακτινοβολίας/ραδιοευαισθητοποιητές. Τα νανοσωματίδια χρυσού (ΝΣ-Au), μεταξύ άλλων χρήσεων, έχουν επιδείξει ισχυρές δυνατότητες ως ραδιοευαισθητοποιητές, λόγω της βιοσυμβατότητας τους και του υψηλού ατομικού αριθμού (Ζ) του χρυσού, που του προσδίδει σημαντικά υψηλότερο συντελεστή μάζας απορρόφησης ενέργειας ακτίνων Χ σε σύγκριση με τους μαλακούς ιστούς. Η ραδιοευαισθητοποίηση μέσω των νανοσωματιδίων χρυσού αποδίδεται στο μηχανισμό αύξησης δόσης, μέσω της παραγωγής δευτερογενών ηλεκτρονίων χαμηλής ενέργειας, μετά από έκθεση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία, και πιο συγκεκριμένα σε ακτινοβολία με χαμηλή γραμμική μεταφορά ενέργειας (LET) και σε χαμηλές ενέργειας φωτονίων στο ενεργειακό εύρος kV. Ωστόσο, είναι πλέον σαφές ότι υπάρχει επίσης μια πληθώρα χημικών και βιολογικών παραγόντων που εμπλέκονται σε αυτή τη δράση. Είναι σημαντικό να υπάρχει μία διάκριση μεταξύ της αύξησης δόσης –δηλαδή της αύξησης της ενέργειας που εναποτίθεται στον καρκινικό όγκο λόγω της παρουσίας των νανοσωματιδίων και της ραδιοευαισθητοποίησης, της αύξησης δηλαδή των βιολογικών επιδράσεων της ακτινοβολίας που παρατηρείται όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με νανοσωματίδια. Κατά τη διάρκεια της ακτινοθεραπείας, ο υγιής ιστός που περιβάλλει την καρκινική περιοχή συνήθως επηρεάζεται από τη θεραπεία. Η συσσώρευση των ΝΣ-Αu στις περιοχές του όγκου μπορεί να οδηγήσει σε τοπική αύξηση της δόσης, ακόμη και με χαμηλές δόσεις ακτινοβολίας, ενώ ταυτόχρονα ελαχιστοποιείται ο κίνδυνος για τον περιβάλλοντα υγιή ιστό. Ο κύριος σκοπός της παρούσας διατριβής είναι να μελετήσει τις βιολογικές αποκρίσεις πολλαπλών ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων στην ιοντίζουσα ακτινοβολία σε συνδυασμό με τη χρήση νανοσωματιδίων χρυσού αξιολογώντας πολλαπλούς παράγοντες, ορισμένοι από τους οποίους δεν έχουν ακόμη διερευνηθεί σε αυτό το ερευνητικό πεδίο. Ο συνδυασμός ιοντιζουσών ακτινοβολιών με ΝΣ-Αu μπορεί να αυξήσει τη ομαδοποίηση των γεγονότων εναπόθεσης ενέργειας στην περιοχή των νανοσωματιδίων οδηγώντας σε πολλαπλές βιολογικές επιπτώσεις. Αυτές οι βιολογικές επιπτώσεις αναφέρονται σε επαγόμενη κυτταρική βλάβη και περιλαμβάνουν βλάβες του DNA και/ή αναστολή επιδιόρθωσης DNA, αλλαγές στον κυτταρικό κύκλο, κυτταρικό θάνατο ή κυτταρική γήρανση. Βιολογικές βλάβες τέτοιας προέλευσης, για παράδειγμα στο DNA, είναι πιο δύσκολο να επιδιορθωθούν σε σύγκριση με μεμονωμένες βλάβες και μπορούν να αυξήσουν τις επιζήμιες επιπτώσεις των ΙΑ προκαλώντας ταυτόχρονα πολλαπλές αλλοιώσεις στο DNA όπως βλάβες βάσεων, μονόκλωνες θραύσεις (SSBs) και δίκλωνες θραύσεις (DSBs) οι οποίες μαζικά συντελούν σε σύνθετες βλάβες στο DNA. Σε αυτή τη διατριβή, δόθηκε έμφαση στην πλήρη ταυτοποίηση αυτών των επιπτώσεων σε κυτταρικό επίπεδο χρησιμοποιώντας πολλές μεθοδολογίες όπως ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης, μικροσκοπία φθορισμού, κυτταρομετρία ροής, κυτταρογενετική, κυτταρικές καμπύλες επιβίωσης και άλλες ανοσοκυτταροχημικές μεθόδους. Η χρήση της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας στοχεύει στη διερεύνηση της κυτταρικής πρόσληψης και στον εντοπισμό των ΝΣ-Αu, αλλά αποτελεί επίσης για πρώτη φορά βασικό εργαλείο διερεύνησης βλαβών στο DNA μετά την επαγόμενη ραδιοευαισθητοποίηση από ΝΣ-Au, παρέχοντας πολύτιμες πληροφορίες για την πολυπλοκότητα των βλαβών που σχηματίζονται. Η ανίχνευση πολύπλοκων βλαβών στο DNA επιδιώκεται εδώ χρησιμοποιώντας πολλαπλές τεχνικές. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιούνται ανοσοκυτταροχημικές τεχνικές τόσο στον ανοσοφθορισμό όσο και στην ηλεκτρονική μικροσκοπία για την οπτικοποίηση των βλαβών του DNA, ανιχνεύοντας ταυτόχρονα ή ξεχωριστά πρωτεΐνες επιδιόρθωσης δίκλωνων θραύσεων όπως η γH2AX ή πρωτεΐνες επιδιόρθωσης βλαβών βάσεων όπως η OGG1. Η ιοντίζουσα ακτινοβολία έχει ως αποτέλεσμα μία πληθώρα κυτταρικών αποτελεσμάτων, συμπεριλαμβανομένου του κυτταρικού θανάτου και της κυτταρικής γήρανσης. Η πιθανή πρόκληση γήρανσης λόγω οξειδωτικού στρες ή βλαβών στο DNA μετά από ραδιοευαισθητοποίηση με ΝΣ-Au, δεν είχε διερευνηθεί μέχρι τώρα. Για το σκοπό αυτό, η κυτταρική επιβίωση καθώς και η κυτταρική γήρανση αξιολογείται μέσω καμπυλών επιβίωσης και ανίχνευσης δεικτών κυτταρικής γήρανσης, αντίστοιχα. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής και σε συνδυασμό με τον μοναδικό ρόλο των ΝΣ-Au, ελέγχεται επίσης και η δράση του αναστολέα επιδιόρθωσης του DNA, Talazoparib, προκειμένου να διερευνηθούν οι συνδυαστικές ραδιοευαισθητοποιητικές δράσεις αυτών των δύο. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ υποδεικνύουν τον σημαντικό ρόλο των νανοσωματιδίων χρυσού ως ραδιοευαισθητοποιητές στη θεραπεία του καρκίνου, εξετάζοντας ωστόσο τους πιθανούς περιορισμούς. Αυτή η αναλυτική μελέτη στοχεύει να αποσαφηνίσει όλες τις λεπτομέρειες γύρω από τη δράση των ΝΣ-Au ως ραδιοευαισθητοποιητές και να εισαγάγει νέες τεχνικές και μεθοδολογίες που πρέπει να εφαρμοστούν προκειμένου να μπορέσουμε στο μέλλον να παρέχουμε μια ακτινοθεραπεία ενισχυμένη με νανοσωματίδια.