Διερεύνηση της επίδρασης του ανοσολογικού τελεστή IFNγ στη βιολογία των νευρικών κυττάρων και της αλληλεπίδρασης των μεταγραφικών παραγόντων CIITA και KLF4 στη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων του συμπλέγματος MHC class II

Abstract

In recent years, a multifaceted synergy between the nervous and the immune systems has emerged. This synergy is accomplished by mechanisms that have not been fully elucidated. It is well known that all processes that are integral to adult neurogenesis (proliferation, differentiation, cell migration) are influenced by immunological effectors, for example interferon-gamma (IFNγ). However, the way by which these two systems interact remains a fascinating unanswered question. The aim of this dissertation was to investigate the impact of IFNγ, a pleiotropic cytokine of the immune system, in neuronal cell biology.The results of this study demonstrated an explicit influence of IFNγ in key properties of neural cells, such as proliferation and differentiation. Using as models human neuroblastoma cell lines we observed that IFNγ reduces the proliferation of the cells by delaying their progression through the S phase of the cell cycle, and at the same time it promotes the onset of early neuronal differentiation markers. Its continuous presence alters the program of retinoic acid (RA)-induced neuronal differentiation and modifies the response of the cells to neurotrophic factors. The neuroblastoma is characterized by high cellular heterogeneity that is systematically used in clinical practice to classify the stages of the disease. There are at least three different cell types present, which are characterized by their ability to interconvert from one type to another with mechanisms which are not yet known (trans- differentiation). We found that IFNγ favors the differentiation of N-type cells, which constitute the tumorigenic population of neuroblastoma, into S-type cells. As a result, the enrichment with S-type cells reduces the ability of the treated cells to form tumors after injection in mice, indicating that IFNγ may enhance the therapeutic effects of RA by promoting the trans-differentiation toward a non-tumorigenic lineage. We also studied the influence of IFNγ in the biology of normal neural progenitor cells isolated from rat hippocampus. The presence of IFNγ resulted in decreased multipotency and accelerated differentiation towards the neuronal lineage whereas the differentiation to glial lineages was not affected.By analyzing the actions of IFNγ in the neuroblastoma cells we found that in addition to altering the cell type composition as well as their cell fate, this cytokinewas also capable to induce the expression of CIITA, the master regulator of the MHC class II genes as well as that of KLF4, a factor with a critical role in many cellular processes, from proliferation and differentiation to tissue homeostasis, inflammation and oncogenesis. We therefore explored for the first time, the potential interplay of these two transcription factors that are concomitantly induced by IFNγ in the neuronal milieu. In particular, we questioned whether the increase of KLF4 by IFNγ contributes to the induction of MHC class II gene expression. We discovered that KLF4 indeed affects the transactivation potential of CIITA, thereby increasing the expression of MHC II molecules in the neural cell environment. This effect is accompanied by cell type-specific changes in the mobility of CIITA in the nucleus as revealed by FRAP experiments, as well as in the stability of the protein through the proteasome pathway. We further showed that these alterations are caused by the direct interaction of KLF4 with the CIITA amino acid residues 174-330. Interestingly, in a recent report, that coincided with the completion of this dissertation, it was shown that the N-terminal domain of CIITA plays an important role in the rapid turnover of the protein, which is directly linked to its transactivation properties, by favoring a more efficient interaction with the components of the basal transcription machinery.

Τα τελευταία χρόνια αναδεικνύεται μια πολυεπίπεδη συνέργεια μεταξύ νευρικού και ανοσοποιητικού συστήματος. Η συνέργεια αυτή, πραγματοποιείται μέσω μηχανισμών, οι οποίοι δεν έχουν αποσαφηνιστεί πλήρως. Είναι γνωστό ότι όλες οι διαδικασίες, οι οποίες αποτελούν αναπόσπαστα στοιχεία της ενήλικης νευρογένεσης (πολλαπλασιασμός, διαφοροποίηση, κυτταρική μετανάστευση) επηρεάζονται από ανοσολογικούς τελεστές, όπως για παράδειγμα η ιντερφερόνη-γ (IFNγ). Ωστόσο ο τρόπος με τον οποίο τα δύο αυτά συστήματα αλληλεπιδρούν παραμένει ένα συναρπαστικό αναπάντητο ερώτημα. Στόχο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η μελέτη της επίδρασης της IFNγ, μιας πλειοτροπικής κυτταροκίνης του ανοσοποιητικού συστήματος, στη βιολογία νευρικών κυττάρων.Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης υπέδειξαν σαφή εμπλοκή της IFNγ, στις σημαντικές βιολογικές διεργασίες των νευρικών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση. Χρησιμοποιώντας ένα παθοφυσιολογικό νευρικό κυτταρικό μοντέλο, κύτταρα ανθρώπινου νευροβλαστώματος, παρατηρήσαμε ότι η IFNγ επιδρά στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, καθυστερώντας τη διέλευσή τους απο τη φάση S του κυτταρικού κύκλου και παράλληλα προωθεί την εμφάνιση πρώιμων δεικτών νευρικής διαφοροποίησης. Η συνεχής παρουσία της, τροποποιεί το πρόγραμμα διαφοροποίησης που επάγεται από το ρετινοϊκό οξύ, (RA) και αλλάζει την απόκριση των κυττάρων στους νευροτροφικούς παράγοντες. Οι αλλαγές αυτές συνοδεύονται από την προοδευτική εμφάνιση, ενός νέου πληθυσμού κυττάρων που διαθέτει όλα τα χαρακτηριστικά του κυτταρικού πληθυσμού S του νευροβλαστώματος. Το νευροβλάστωμα χαρακτηρίζεται από κυτταρική ετερογένεια η οποία χρησιμοποιείται συστηματικά στην κλινική πρακτική για την κατηγοριοποίηση των σταδίων της νόσου. Συναντώνται τουλάχιστον τρείς διαφορετικοί τύποι κυττάρων, ένα από τα χαρακτηριστικά των οποίων είναι η ικανότητά τους να αλληλομετατρέπονται από τον ένα τύπο στον άλλο με μηχανισμούς που δεν είναι γνωστοί (δια- διαφοροποίηση). Βρήκαμε ότι η η IFNγ επάγει τη δια-διαφοροποίηση των κυττάρων τύπου Ν τα οποία συνιστούν τον ογκογόνο πληθυσμό του νευροβλαστώματος, σε κύτταρα τύπου S. Ο εμπλουτισμός του πληθυσμού με κύτταρα τύπου S, μειώνει την ικανότητά του να σχηματίζει όγκους μετά από ένεση σε ποντίκια, υποδεικνύοντας ότι η IFNγ μπορεί να ενισχύει τη «θερεαπευτική» δράση του RA, προωθώντας την διαφοροποίηση προς μια μη-ογκογονική γενεαλογία.Μελετήσαμε επίσης την επίδραση της IFNγ, στη βιολογία φυσιολογικών νευρικών κυττάρων, απομονωμένων απο ιππόκαμπο αρουραίου. Παρατηρήσαμε μείωση του δυναμικού πολυδυναμίας και επιτάχυνση του πρόγραμματος διαφοροποίησης προς τη νευρική μοίρα. Αντίθετα η διαφοροποίηση των κυττάρων προς τη γλοιακή μοίρα δεν επηρεάστηκε.Αναλύοντας τη δράση της IFNγ στα νευροβλαστωματικά κύτταρα, διαπιστώσαμε ότι παράλληλα με την αλλαγή στη σύσταση του κυτταρικού πληθυσμού και την κυτταρική μοίρα, αυτή η κυτταροκίνη επάγει τον CIITA οδηγώντας σε μια δραματική αύξηση της έκφρασης των γονιδίων MHCII, αλλά και την έκφραση του KLF4, ενός παράγοντα καθοριστικής σημασίας για πολλές κυτταρικές διεργασίες από τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση μέχρι την ομοιόσταση των ιστών, τη φλεγμονή και την ογκογένεση. Έτσι, διερευνήσαμε για πρώτη φορά, την αλληλεπίδραση αυτών των δύο μεταγραφικών παραγόντων που επάγονται ταυτόχρονα από IFNγ στο νευρικό περιβάλλον. Αναρωτηθήκαμε ειδικότερα, κατά πόσον η επαγωγή του KLF4 από την IFNγ, συμβάλλει στην επαγωγή της έκφρασης των γονιδίων MHCΙΙ. Διαπιστώσαμε ότι ο KLF4 επηρεάζει το μεταγραφικό δυναμικό του CIITA οδηγώντας σε αύξηση της έκφρασης των μορίων του συμπλέγματος MHC II στο νευρικό περιβάλλον. Η δράση αυτή συνοδεύεται από αλλαγές στην κινητικότητα του CIITA στον πυρήνα, όπως είδαμε με πειράματα FRAP, αλλά και στην σταθερότητα της πρωτεΐνης μέσω της δράσης του πρωτεασώματος, και μάλιστα με έναν κυτταρο-ειδικό τρόπο. Βρήκαμε ότι οι μεταβολές αυτές προκαλούνται μέσω της άμεσης αλληλεπίδρασης του KLF4, με τα αμινοξικά κατάλοιπα 174-330 του CIITA. Σε μια αναφορά που συνέπεσε με την ολοκλήρωση της διατριβής δείχθηκε ότι το αμινο-τελικό άκρο του CIITA είναι πολύ σημαντικό για την γρήγορη αποικοδόμηση της πρωτεΐνης, η οποία συνδέεται άμεσα με το μεταγραφικό του δυναμικό, ευνοώντας την αποτελεσματικότερη αλληλεπίδραση με τη βασική μεταγραφική μηχανή.