Μελέτη διεργασιών σύνθεσης νανοσυστημάτων και φιλμ χιτοζάνης

Abstract

Chitosan is a natural, linear, and cationic polysaccharide of randomly distributed D-glucosamine and N acetyl-D-glucosamine units linked with β (1→4) linkage. Derived from chitin, chitosan is biodegradable and biocompatible. The nontoxic nature, antioxidant and antimicrobial properties permit its use in biomedical and pharmaceutical technology, food and packaging technology, cosmetology, agriculture, etc. The existence of three functional groups in chitosan's structure, namely an amine, a secondary hydroxyl, and a primary hydroxyl group, enable beneficial modifications which can ameliorate the molecule's properties without altering the core physicochemical and biochemical characteristics. In addition, it is a relatively easy-to-manage material: it dissolves in dilute aqueous acidic solutions. Finally, a significant advantage is its ability to be organized in different forms: forming nanoparticles and nanocapsules, fibers, films, or hydrogels.Three chitosan-containing processes have been studied in this thesis:(a) the synthesis of nanoparticles encapsulating bioactive molecules and inclusion complexes (b) the formation of elastic films incorporating green solvents and extracts(c) the synthesis of silver nanoparticles with chitosan as the stabilising and shape-forming agentChapter 1 is the introductory chapter of this thesis, presenting the essential information about chitosan, Green Chemistry, green solvents, and experimental design. Green Chemistry is the grounds of sustainable development, and replacing the commonly used solvents with green alternatives constitutes a priority. Ionic Liquids and Deep Eutectic Solvents (DESs) have been used to synthesise silver nanoparticles and elastic films, respectively. Experimental design is a valuable tool for minimising the experiments required by creating a set of procedures to systematically test a hypothesis.The first part of the dissertation presents the synthesis of chitosan nanoparticles with the concurrent encapsulation of bioactive compounds and β-cyclodextrin inclusion complexes. Chapter 2 gives the theoretical background on nanotechnology and its everyday applications. Focus is given to ionic gelation, which is probably the most widespread method for forming chitosan nanoparticles. This method is based on the cross-linking of cationic chitosan and anionic tripolyphosphate (TPP) that binds to the free amino groups of chitosan. Furthermore, the mostly used characterisation methods for nanosystems are described. In Chapter 3, preliminary experiments were conducted to understand the nanoparticle formation process in-depth. Thereafter, the study of encapsulation of tyrosol (TYR/CS) and of the chalcone [(E)-1-(2D-hydroxyphenyl)-3-(2,4,5-trimethoxyphenyl) prop-2-enone] (TYR/CHALC) into chitosan nanoparticles is presented. Box-Behnken experimental design was applied for each nanosystem to identify the optimal synthetic conditions and obtain mathematical expressions describing the profile of selected responses of the system. For both systems, nanoparticles of strong positive surface charge, up to 56.4 mV, were obtained. The encapsulation efficiency ranged from 18 to 62%, while the overall process yield was relatively low, ranging from 10 to 31.5%. The encapsulation of the two molecules was confirmed by TGA and DSC.In Chapter 4, the encapsulation of an inclusion complex in chitosan nanoparticles was studied. More specifically, a tyrosol - β-cyclodextrin inclusion complex was formed (TYR-βCD) and was coated with chitosan (TYR-βCD/CS), using the synthetic methodology developed previously. Some apparent similarities are observed from the comparative study of the TYR/CS and TYR-βCD/CS nanoparticles. In both systems, it was observed that the smaller sized particles presented a good ζ‑potential, which is indicative of a very stable formulation. Yet; the main difference observed between the two systems is the effect of the encapsulating molecule on the ζ‑potential, attributed to the fact that the inclusion complex is negatively charged, causing strong electrostatic interaction between the two carriers.Thermal analysis confirmed that the additional coating of the inclusion complex protects the tyrosol during the heat treatment. At the same time, the release profile shows that the coating resulted in a sustained release of tyrosol and slowed down the initial burst effect that was otherwise observed. Finally, the interaction of tyrosol and the corresponding nanosystems with calf-thymus DNA (ctDNA) was investigated. The results show that tyrosol is a ctDNA groove binder, and molecular modeling studies confirmed this. The same mode of binding was found for the TYR-βCD and TYR-βCD /CS nanosystems.The second part of the dissertation presents the preparation and characterisation of elastic chitosan films incorporating green solvents and extracts. Novelty of this study constitutes the direct dissolution of chitosan in dilute aqueous solutions of natural deep eutectic solvents.Chapter 5 is the introductory chapter of the second part of this thesis, where a literature review on chitosan film formation and the incorporation of Deep Eutectic Solvents (DES) is presented. In Chapter 6, the Natural Deep Eutectic Solvents (NaDESs) of betaine:lactic acid (bet:LA) and choline chloride:lactic acid (ChCl:LA) were used. In an aqueous solution of 1% NaDES, chitosan was dissolved in concentration of 0.2%. Thereafter, the casting technique was used for the preparation of elastic films and their properties were compared with three conventionally prepared chitosan films. The addition of NaDESs led to a 2.6-4.5-fold increase of the water vapour permeability (WVP), 86-95% decrease of the burst strength, and 13-78% increase of elongation at burst. In addition, the betaine-containing films were twice as elastic as the choline chloride-containing films, while the WVP was reduced by 50%.The study indicated that the NaDES films are not identical to those produced from the direct mixture of NaDES's components. The observed differences are small but statistically significant. In Chapter 7, plant extraction via various methodologies is investigated. Firstly, the extraction of rosemary leaves with hydroethanolic solvents was performed. Next, the use of enzymatic extraction as a pretreatment step was examined, leading to the maximization of the total flavonoid content in the extract. The extraction of the wild rose fruit was performed with NaDESs and the process was optimised. The total phenolic and flavonoid content of the extracts was assessed. Eight chitosan films were formed, incorporating the extracts of the wild rose with various NADESs. Namely, the films formed were F/ChCl:LA from NaDES choline chloride: lactic acid, F/bet:LA from NaDES betaine:lactic acid, F/L-Pro:LA from NaDES L-proline: lactic acid, F/ β-Ala:LA from NaDES β-alanine:lactic acid, F/bet:CA:W from NaDES betaine: citric acid: water, F/L-Pr:CA:W from NaDES L-proline:citric acid:water, F/ChCl:CA from NaDES choline chloride:citric acid and F/bet:LevA from NaDES betaine:levulinic acid.The evaluation of the results revealed that the solubility of chitosan is higher in the presence of lactic acid compared to citric acid, although the pH value is similar. In other words, it seems that the solubility of chitosan is not exclusively dependent on the pH of the solution but also on the structural characteristics of its components and the different interactions with the polymer chain of chitosan.In the last part, consisting of Chapter 8, the formation of flower-shaped silver particles is discussed, and their properties are assessed. A green methodology for irregularly shaped silver nanoparticles was developed, using a new ionic fluid as the reducing agent and chitosan as the stabilizing agent for the particles and their shape. The ionic liquid consisting of ascorbic acid and ethanolamine was initially formed and by FT-IR and NMR spectroscopy, the stereochemical interaction of the two components was determined.Silver particles were then synthesised in a chitosan solution, and their size ranged from 268.4 nm to 1488.0 nm. Scanning electron microscopy (SEM) showed that the particles were flower-shaped. Finally, the properties of nanoparticles showed remarkable stability over time and reproducibility.Finally, Chapter 9 summarizes the lead results obtained from the three aforementioned processes of chitosan, the publications in scientific journals and conferences posters that emerged during the research activity. Finally, recommendations for future research are suggested.

Η χιτοζάνη αποτελεί ένα γραμμικό πολυκατιονικό πολυσακχαρίτη, που προέχεται από τη χιτίνη. Αποτελείται από επαναλαμβανόμενες μονάδες D-γλυκοζαμίνης και N ακετυλο-γλυκοζαμίνης ενωμένες με (1,4)-β γλυκοζιτικό δεσμό. Αξιοποιείται σε πολλές εφαρμογές της καθημερινότητας, όπως στη βιοϊατρική και φαρμακευτική τεχνολογία, στην τεχνολογία τροφίμων και τις συσκευασίες, την κοσμετολογία, τη γεωργία κ.α. καθώς παρουσιάζει πολύ ενδιαφέρουσες ιδιότητες . Η χιτοζάνη διαθέτει αντιοξειδωτική και αντιμικροβιακή δράση, αιμοστατική και βλεννοσυγκολλητική ικανότητα, ενώ είναι ένα φιλικό προς το περιβάλλον πολυμερές, βιοαποικοδομήσιμο και βιοσυμβατό. Είναι ένα σχετικά εύκολα διαχειρίσιμο υλικό: διαλύεται σε αραιά υδατικά διαλύματα οξέων και διαθέτει τρεις λειτουργικές ομάδες, μία αμινομάδα και δύο υδροξυλομάδες, γεγονός που την καθιστά εύκολα τροποποιήσιμη με στόχο την προσαρμογή των ιδιοτήτων της στις ανάγκες τις εκάστοτε εφαρμογής. Τέλος, ιδιαιτέρως σημαντικό πλεονέκτημα αποτελεί η δυνατότητά της να οργανώνεται σε διαφορετικές μορφές: σχηματίζοντας νανοσωματίδια και νανοκάψουλες, ίνες, φιλμ ή υδρογέλες.Στην παρούσα διατριβή, μελετήθηκαν τρεις διεργασίες που περιέχουν τη χιτοζάνη:(α) η σύνθεση νανοσωματιδίων με εγκλεισμό βιοδραστικών μορίων και συμπλόκων κυκλοδεξτρίνης με εγκλεισμένα βιοδραστικά μόρια (β) ο σχηματισμός ελαστικών φιλμ με ενσωμάτωση πράσινων διαλυτών και εκχυλισμάτων(γ) η σύνθεση νανοσωματιδίων αργύρου με χιτοζάνη ως σταθεροποιητικό και κατευθυντήριο της δομής παράγονταΤο Κεφάλαιο 1 αποτελεί το εισαγωγικό κεφάλαιο της διατριβής όπου παρουσιάζονται οι βασικότερες πληροφορίες για τη χιτοζάνη, την Πράσινη Χημεία, τους πράσινους διαλύτες και τον πειραματικό σχεδιασμό. Η Πράσινη Χημεία είναι η βάση της αειφόρου ανάπτυξης και η αντικατάσταση των κοινώς χρησιμοποιούμενων διαλυτών με πράσινες εναλλακτικές αποτελεί προτεραιότητα. Στην παρούσα διατριβή έχουν χρησιμοποιηθεί Ιοντικά Υγρά και Βαθέως Ευτηκτικοί Διαλύτες (Deep Eutectic Solvents, DESs) στη σύνθεση των νανοσωματιδίων αργύρου και στη διεργασία σχηματισμού φιλμ χιτοζάνης, αντίστοιχα. Ο πειραματικός σχεδιασμός έχει εφαρμοστεί σε διαφορά στάδια τα μελέτης καθώς αποτελεί εργαλείο για την ελαχιστοποίηση των πειραμάτων που πρέπει να διεξαχθούν. Ακολουθεί η μελέτη της πρώτης διεργασίας που είναι ο σχηματισμός νανοσωματιδίων χιτοζάνης και ο εγκλεισμός βιοδραστικών ενώσεων και συμπλόκων κυκλοδεξτρίνης με εγκλεισμένα βιοδραστικά μόρια,Στο Κεφάλαιο 2, παρουσιάζονται θεωρητικά δεδομένα για τη νανοτεχνολογία, τα νανοσυστήματα, τις μεθόδους χαρακτηρισμού των νανοσωματιδίων καθώς και εφαρμογές που βρίσκουν αυτά στην καθημερινότητά μας. Στο κεφάλαιο αυτό, περιγράφεται η μέθοδος σχηματισμού των νανοσωματιδίων χιτοζάνης , που είναι η ιονική πηκτωμάτωση (ionic gelation) με τριπολυφωσφορικό ανιόν (ΤΡΡ), κατά την οποία πραγματοποιείται διασύνδεση (cross-linking) των πρωτονιωμένων αμινομάδων του πολυμερούς με το ανόργανο πολυανιόν. Αρχικά, στο Κεφάλαιο 3, πραγματοποιήθηκαν προκαταρκτικά πειράματα για την καλύτερη κατανόηση της διεργασίας του σχηματισμού νανοσωματιδίων και τη αρχική αξιολόγηση των παραμέτρων σύνθεσης. Ακολουθεί, ο εγκλεισμός της τυροσόλης σε νανοσωματίδια χιτοζάνης (TYR/CS), καθώς και της χαλκόνης [(Ε)-1-(2΄-υδροξυφαινυλο)-3-(2,4,5-τριμεθοξυφαινυλο)προπ-2-ενόνη] (TYR/CHALC), η σύνθεση της οποίας πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Οργανικής Χημείας και παρουσιάζει ενδιαφέρουσα βιολογική δράση. Για το εκάστοτε σύστημα, εφαρμόστηκε πειραματικός σχεδιασμός Box-Behnken για τον προσδιορισμό των βέλτιστων συνθηκών σύνθεσης και την εξαγωγή μαθηματικών μοντέλων που περιγράφουν το προφίλ των επιλεγμένων αποκρίσεων του συστήματος. Και για τα δύο νανοσυστήματα, προέκυψαν σωματίδια από 115 nm και ισχυρά θετική επιφανειακή φόρτιση, μέχρι 56.4 mV, λόγω της παρουσίας του πολυμερούς. Η συγκέντρωση της χιτοζάνης βρέθηκε να είναι ο πιο σημαντικός παράγοντας για όλες τις αποκρίσεις που μελετήθηκαν, όπως το μέγεθος και η ομοιομορφία των σωματιδίων. Η απόδοση εγκλεισμού και για τα δύο συστήματα κυμάνθηκε μεταξύ 18 και 62% ενώ η συνολική απόδοση της διεργασίας ήταν σχετικά χαμηλή και κυμάνθηκε από 10 έως 31.5%. Οι θερμικές ιδιότητες των νανοσυστημάτων αξιολογήθηκαν με TGA και DSC και επιβεβαιώθηκε σε όλες τις περιπτώσεις ο επιτυχής εγκλεισμός των δύο ενώσεων. Στη συνέχεια, στο Κεφάλαιο 4, μελετήθηκε ο εγκλεισμός ενός συμπλόκου σε νανοσωματίδια χιτοζάνης. Πιο συγκεκριμένα, σχηματίστηκε σύμπλοκο εγκλεισμού της τυροσόλης με β-κυκλοδεξτρίνη (TYR-βCD), το οποίο στη συνέχεια, επικαλύφθηκε από το πολυμερές (TYR-βCD/CS). Εφαρμόστηκε η μεθοδολογία σχηματισμού των νανοσωματιδίων που αναπτύχθηκε στο προηγούμενο κεφάλαιο. Από τη συγκριτική μελέτη των νανοσωματιδίων TYR/CS και TYR-βCD/CS, παρατηρούνται κάποιες σαφείς ομοιότητες. Και στα δύο συστήματα, παρατηρήθηκε ότι τα μικρότερου μεγέθους σωματίδια παρουσίασαν ένα ισχυρά θετικό ζ δυναμικό, ενδεικτικό μιας σταθερής σύνθεσης. Η κύρια διαφοροποίηση μεταξύ των δύο συστημάτων νανοσωματιδίων είναι η επίδραση της ποσότητας του συμπλόκου στην τιμή του ζ δυναμικού. Ο λόγος αυτής της διαφοράς αποδίδεται στο γεγονός ότι το σύμπλοκο εγκλεισμού είναι αρνητικά φορτισμένο οπότε υπάρχει ισχυρή ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο φορέων.Επιπλέον, από τη θερμική ανάλυση των δύο νανοσυστημάτων και τη μελέτη του προφίλ απελευθέρωσης της τυροσόλης σε υδατικό διάλυμα, βρέθηκε ότι η επιπλέον επικάλυψη του συμπλόκου με το πολυμερές, προστατεύει την τυροσόλη κατά τη θερμική επεξεργασία των δειγμάτων και επιβραδύνει την απελευθέρωσή της στο διάλυμα. Τέλος, μελετήθηκε η αλληλεπίδραση της τυροσόλης και των νανοσωματιδίων που σχηματίστηκαν με το DNA θύμου αδένα μόσχου (Calf-thymus DNA, ctDNA). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η τυροσόλη σταθεροποιείται στην κοιλότητα της μικρής αύλακας του ctDNA. Ο ίδιος τρόπος δέσμευσης βρέθηκε για τα νανοσυστήματα TYR-βCD, και TYR-βCD/CS, ενώ δεν εντοπίστηκε αλληλεπίδραση μεταξύ του ctDNΑ και της χιτοζάνης ή του TYR/CS.Ακολουθεί η παρουσίαση της διεργασίας σχηματισμού ελαστικών φιλμ χιτοζάνης με ενσωμάτωση πράσινων διαλυτών και εκχυλισμάτων. Καινοτομία αυτής της μελέτης αποτελεί η απευθείας διάλυση της χιτοζάνης σε αραιά υδατικά διαλύματα φυσικών βαθέως ευτηκτικών διαλυτών. Το Κεφάλαιο 5 αποτελεί το εισαγωγικό κεφάλαιο του δεύτερου μέρους της διατριβής και συνοψίζονται τα ευρήματα της βιβλιογραφικής ανασκόπησης που αφορούν στο σχηματισμό φιλμ χιτοζάνης και την ενσωμάτωσή των βαθέως ευτηκτικών διαλυτών. Περιγράφονται οι πράσινες διεργασίες εκχύλισης βιοδραστικών ενώσεων από φυτά. Στο Κεφάλαιο 6, χρησιμοποιήθηκαν τα NaDES βεταΐνης:γαλακτικού οξέος (bet:LA NaDES) και χλωριούχου χολίνης:γαλακτικού οξέος (ChCl:LA NaDES). Σε συγκέντρωση 1%, τα υδατικά διαλύματα των δύο NaDESs ήταν αρκετά όξινα για τη διάλυση χιτοζάνης σε περιεκτικότητα 0.2%. Στη συνέχεια, μέσω της διαδικασίας χύτευσης (casting), δηλαδή την απομάκρυνση του νερού από το διάλυμα, σχηματίστηκαν φιλμ τα οποία ήταν ελαστικά, σε αντίθεση με τα φιλμ που προέκυψαν από τη διάλυση του πολυμερούς σε διαλύματα οξικού οξέος και γαλακτικού οξέος. Η προσθήκη των NaDESs προσέδωσε ελαστικότητα στα φιλμ και αύξησε την διαπερατότητα των υδρατμών (WVP) κατά 2.6 - 4.5 φορές, σε σύγκριση με τα φιλμ που περιέχουν οξικό οξύ. Επιπλέον τα φιλμ που περιέχουν NaDES παρουσίασαν 86 - 95% χαμηλότερη αντίσταση στη θραύση και 13 - 78% υψηλότερη ικανότητα επιμήκυνσης. Τα φιλμ που περιείχαν βεταΐνη ήταν δύο φορές πιο ελαστικά από εκείνα περιείχαν χλωριούχο χολίνη, ενώ η διαπερατότητα υδρατμών ήταν μειωμένη κατά 50%. Στα πλαίσια διερεύνησης των παραγόντων που επηρεάζουν τις ιδιότητες των συγκεκριμένων φιλμ βρέθηκε ότι η ενσωμάτωση των συστατικών των NaDESs ως ένα ήδη σχηματισμένο NaDES ή ως φυσικό μίγμα, οδηγούν στην παρατήρηση διαφοροποιήσεων στις τελικές ιδιότητες. Οι διαφοροποιήσεις αυτές δεν καθιστούν εφικτή την εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων, αποτελούν όμως ένδειξη ότι στις τελικές ιδιότητες επιδρούν παράγοντες όπως ο διαλύτης που θα χρησιμοποιηθεί, αλλά και η ποσότητα και ο τρόπος με τον οποίο θα προστεθεί στο αρχικό διάλυμα. Στο Κεφάλαιο 7, αρχικά μελετάται διεξοδικά η εκχύλιση βιοδραστικών ενώσεων από φυτά μέσω διαφορετικών μεθοδολογιών. Αρχικά, χρησιμοποιούνται συμβατικοί, υδροαιθανολικοί διαλύτες για την εκχύλιση των φύλλων δεντρολίβανου και πραγματοποιείται ενζυμική προκατεργασία του υλικού με στόχο να μελετηθεί η επίδραση αυτής της προκατεργασίας στο τελικό εκχύλισμα. Πραγματοποιήθηκε επίσης εκχύλιση του αποξηραμένου καρπού του άγριου τριαντάφυλλου με βαθέως ευτηκτικούς διαλύτες, και προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης για τη μεγιστοποίηση του ολικού περιεχόμενου φλαβονοειδών στο εκχύλισμα. Από τα εκχυλίσματα που προέκυψαν, σχηματίστηκαν οχτώ φιλμ χιτοζάνης. Τα φιλμ που σχηματίστηκαν ήταν τα F/ChCl:LA από το NaDES χλωριούχου χολίνης:γαλακτικού οξέος, F/bet:LA από το NaDES βεταΐνης:γαλακτικού οξέος, F/L-Prο:LA από το NaDES L-προλίνης:γαλακτικού οξέος, F/β-Ala:LA από το NaDES β-αλανίνης:γαλακτικού οξέoς, F/bet:CA:W από το NaDES βεταΐνης:κιτρικού οξέος:νερού, F/L Prο:CA:W από το NaDES L προλίνης:κιτρικού οξέος:νερού, F/ChCl:CA από το NaDES χλωριούχος χολίνη:κιτρικό οξύ και F/bet:LevA από το NaDES βεταΐνη:λεβουλινικό οξύ. Από την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων προέκυψε ότι, η διαλυτότητα της χιτοζάνης είναι υψηλότερη παρουσία γαλακτικού οξέος σε σύγκριση με το κιτρικό οξύ, παρόλο που η τιμή του pH είναι παρεμφερής για τα υδατικά διαλύματα και των αντίστοιχων εκχυλισμάτων σε περιεκτικότητα 1%. Φαίνεται, δηλαδή, ότι η διαλυτότητα της χιτοζάνης δεν εξαρτάται αποκλειστικά από το pH του διαλύματος αλλά και από τα δομικά χαρακτηριστικά των συστατικών του και τις διαφορετικές αλληλεπιδράσεις με την πολυμερική αλυσίδα της χιτοζάνης.Στο τελευταίο μέρος, αποτελούμενο από το Κεφάλαιο 8, αναπτύχθηκε πράσινη μεθοδολογία σχηματισμού νανοσωματιδίων αργύρου ακανόνιστου σχήματος, χρησιμοποιώντας ένα νέο ιοντικό υγρό ως τον αναγωγικό παράγοντα και τη χιτοζάνη ως παράγοντα σταθεροποίησης των σωματιδίων και του σχήματός τους. Αρχικά σχηματίστηκε το ιοντικό υγρό αποτελούμενο από ασκορβικό οξύ και αιθανολαμίνη και μέσω φασματοσκοπίας FT-IR και NMR μίας και δύο διαστάσεων, προσδιορίστηκε η στερεοχημική αλληλεπίδραση των δύο συστατικών. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε παρασκευή νανοσωματιδίων/μικροσωματιδίων αργύρου σε διάλυμα χιτοζάνης. Τα σωματίδια που σχηματίστηκαν παρουσίασαν μέγεθος από 268.4 nm μέχρι 1488.0 nm. Η απεικόνιση της μορφολογίας των σωματιδίων μέσω ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης (SEM) έδειξε ότι το ακανόνιστο σχήμα τους με τις πολλές ακμές μοιάζει με εκείνη ενός λουλουδιού. Τέλος, οι ιδιότητες των νανοσωματιδίων, παρουσίασαν αξιοσημείωτη σταθερότητα στο χρόνο και αναπαραγωγισιμότητα.Τέλος, στο Κεφάλαιο 9 συνοψίζονται τα σημαντικότερα αποτελέσματα που προέκυψαν από τις τρεις διεργασίες της χιτοζάνης, οι δημοσιεύσεις σε επιστημονικά περιοδικά και οι αναρτήσεις σε διεθνή και ελληνικά συνέδρια. Τέλος, αναφέρονται προτάσεις για μελλοντική έρευνα.