Ταυτοποίηση αποθεμάτων τσιπούρας (Sparus aurata Linnaeus, 1758) στον Ελλαδικό χώρο: μορφολογική και γενετική ποικιλομορφία

Abstract

Τhe identification of fish stock composition is important in fisheries science, as it is an integral part of fisheries management and aims at sustainable production. Many methods have been used in fish stock discrimination, including morphological and genetic indices and life history traits. The aim of the present PhD thesis was the identification of natural stocks of Gilthead sea bream in Greece through the use of morphological and genetic characters, as well as the study of the phenotypic variability limits of otoliths and scales of the species, in response to the fish growing environment. Specifically, a comparative study was performed on the otolith morphology (shape, size and asymmetry), body shape and genetic diversity (microsatellite DNA) of Gilthead sea bream (Sparus aurata) of different geographical origins. Samples were collected from the North, West-central (Maliakos) and East-central (Kalymnos) Aegean, from different regions of the Ionian Sea (Central Ionian, Corfu, Patraikos), as well as from the Missolonghi lagoon during 2014-2018. Fish from two different aquaculture farms, one from the Ionian and one from the Aegean Sea, were used (control samples). The rate of regenerated scales is greater in reared compared to wild fish, as the former are succumbed into mechanical stress, which is provoked by aquaculture manipulations. The degree of scale regeneration (SRD) was used to assign wild-caught fish as actually wild or, potentially, aquaculture escapees, in order to estimate the actual morphological and genetic diversity of the species natural populations. The wild-caught specimens were discriminated into three categories based on their SRD levels, the increase of which increases the likelihood of the presence οf aquaculture escapees: in the group of wild fish with low probability to include escapees (L30: ≤30% SRD), in the group of fish with probability to include escapees (Μ30-60: 31-60% SRD) and in the group of fish with high probability to include escapees (Μ60: >60% SRD). The different morphological and genetic characters were examined in accordance to the natural phenotypic variation in relation to the contribution of possible escapees in each geographically distinct sample. Furthermore, the differences between wild-caught and reared fish were explored.In the study of the phenotypic variability limits, the effect of temperature (17, 20 or 23°C) during the short embryonic and yolk-sac larval period was tested on the otolith plasticity of Gilthead sea bream experimental populations, during the period between the stage of metamorphosis (56-58 days' post hatching, dph) and the juvenile stage (93-95 dph). Also, the effect of different growth environment was examined, on the otolith morphology of reared sea bream populations, in the period between the juvenile stage (122 dph) and adult stage (314-393 dph). To evaluate the SRD as a reliable index for distinguishing aquaculture escapees, the evolution of SRD levels in the reared populations was monitored, from the stage of metamorphosis to the end of the rearing process.An elliptic Fourier analysis and a geometric morphometric technique were used for the study of otolith shape and body shape variation, respectively. For the examination of the asymmetry on otolith shape and size characteristics, the variance of difference between the two sides of the body and the mean absolute difference between the body sides were used. For the otolith size differences, the standardized values of maximum length, maximum weight, surface and perimeter were calculated. The shape differences between the different geographical groups were examined using CAP (Canonical Analysis of Principal Coordinates). A Canonical Variate Analysis (CVA) was performed to check the shape differences (otolith and body shape) between reared (control) and wild-caught fish. In the remainder comparisons, the statistical significance of the differences between groups were tested using parametric and non-parametric tests. The differences in genetic diversity between groups, were examined by the indices of genetic (FST) differentiation.The results of the present study, demonstrated three phenotypically sea bream stocks: the Aegean, Ionian and Missolonghi lagoon stocks. However, the examination of genetic diversity showed a genetically uniform stock in the area of Greece. In the categories of wild-caught fish, with increasing possibility to include aquaculture escapees, the examination of shape (otolith and body) variation did not show clear geographical differentiation between groups. In the geographical areas where the presence of fish with high levels of SRD was increased, the fish with high possibility to include escapees (M60) presented significant higher levels of otolith size and asymmetry compare to their wild counterparts (L30). However, within the different geographical regions there was no significant genetic differentiation between individuals with different SRD levels. Wild-caught and reared fish differed significantly in their morphological and genetic characteristics.The examination of the phenotypic variability limits on Gilthead sea bream showed that the otolith shape and otolith asymmetry from the stage of metamorphosis to juvenile stage, changed significantly depending on the early developmental temperature of the fish. Furthermore, the shape, size and asymmetry of the otoliths differed significantly depending on the growth environment of juvenile and adult fish. The evolution of the SRD levels demonstrated that scales are being lost continuously, from the onset of squamation (11.2 ± 5.7% mean SRD, 58 days' post hatching, dph, 2.0 cm standard length, SL) until the end of the on-growing period (98.7 ± 3% to 99.8 ± 0.9% mean SRD, 314-393 dph, 21.7-21.9 cm SL). At the transition between the hatchery period and the on-growing in sea cages, fish presented a wide distribution of SRD, ranging from 40 to 92% (122 dph, 5.1 cm SL).The importance of the results was discussed regarding the sea bream stock discrimination, the correlation of SRD with the age of escaping reared fish, the distinction of potential aquaculture escapees from wild fish, as well as the wild and reared differences. Additionally, was discussed the otolith plasticity in response to different environmental factors during fish development. The main results revealed the existence of three "phenotypic" stocks with similar genetic characteristics. Otolith morphology is a highly plastic character and is a reliable tool in the study of the environmental effects on fish physiology. Reared fish differ from wild-caught fish, both phenotypically and morphologically. The SRD increased continuously with fish age and is a useful index of distinguishing escapees based on morphology. However, it was not related to any difference in the genetic composition between wild and possible escapees.

Η ταυτοποίηση των ιχθυοαποθεμάτων είναι μείζονος σημασίας για τη σύγχρονη αλιευτική επιστήμη καθώς αποτελεί αναπόσπαστο κομμάτι της αλιευτικής διαχείρισης και στόχο έχει την αειφόρο παραγωγή. Στη διάκριση των αποθεμάτων ψαριών έχει χρησιμοποιηθεί πλήθος μεθόδων, οι οποίες περιλαμβάνουν τη χρήση μορφολογικών και γενετικών δεικτών καθώς και χαρακτηριστικών της ιστορίας ζωής των ψαριών. Στόχος της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής, ήταν η ταυτοποίηση φυσικών αποθεμάτων τσιπούρας στον Ελλαδικό χώρο μέσω της χρήσης μορφολογικών και γενετικών χαρακτήρων, καθώς και η μελέτη των ορίων φαινοτυπικής διακύμανσης των ωτολίθων και των λεπιών του είδους, ως απόκριση στο περιβάλλον ανάπτυξης. Για την ταυτοποίηση των αποθεμάτων, πραγματοποιήθηκε συγκριτική μελέτη γεωγραφικά διακριτών δειγμάτων τσιπούρας (Sparus aurata), ως προς τη φαινοτυπική διακύμανση των ωτολίθων (σχήμα, μέγεθος και ασυμμετρία) και του σώματος (σχήμα) των ψαριών, καθώς και ως προς την ποικιλομορφία γενετικών τόπων μικροδορυφορικού DNA. Τα δείγματα συλλέχθηκαν από το Βόρειο, το Κεντρικό-Δυτικό (Μαλιακός Κόλπος) και το Κεντρικό-Ανατολικό (Κάλυμνος) Αιγαίο, από διαφορετικές περιοχές του Ιονίου πελάγους (Κεντρικό Ιόνιο, Κέρκυρα, Πατραϊκός) καθώς και από τη λιμνοθάλασσα του Μεσολογγίου τα έτη 2014-2018. Δείγματα από δύο διαφορετικές μονάδες εκτροφής, μια από το Ιόνιο και μια από το Αιγαίο, χρησιμοποιήθηκαν ως δείγματα ελέγχου. Τα ψάρια εκτροφής παρουσιάζουν υψηλότερο ποσοστό αναγεννημένων λεπιών σε σχέση με τα άγρια, λόγω των μηχανικών καταπονήσεων που υφίστανται από τους ανθρώπινους χειρισμούς στις μονάδες καλλιέργειας. O βαθμός αναγέννησης των λεπιών (SRD) χρησιμοποιήθηκε ως κριτήριο διάκρισης των εν δυνάμει δραπετών από ιχθυοκαλλιέργειες ατόμων, με σκοπό τη διερεύνηση της πραγματικής μορφολογικής και γενετικής ποικιλομορφίας των άγριων πληθυσμών του είδους. Τα άτομα φυσικής προέλευσης διαχωρίστηκαν σε 3 ομάδες με βάση τα επίπεδα του SRD, η αύξηση των οποίων αυξάνει την πιθανότητα παρουσίας δραπετών ιχθυοκαλλιέργειας: στην ομάδα των άγριων ατόμων με μικρή πιθανότητα παρουσίας δραπετών (L30: ≤30% SRD), στην ομάδα με πιθανότητα παρουσίας δραπετών (Μ30-60: 31-60% SRD) και στην ομάδα με υψηλή πιθανότητα παρουσίας δραπετών (Μ60: >60% SRD). Οι διαφορετικοί μορφολογικοί και γενετικοί δείκτες εξετάστηκαν ως προς τη διακύμανση του φυσικού φαινοτύπου από την πιθανή συμβολή των δραπετών ψαριών εντός των γεωγραφικά διακριτών δειγμάτων. Επιπλέον, διερευνήθηκαν οι διαφορές μεταξύ των εκτρεφόμενων (δείγματα ελέγχου) και των ατόμων φυσικής προέλευσης. Στη μελέτη των ορίων της φαινοτυπικής διακύμανσης, εξετάστηκε η επίδραση της θερμοκρασίας (17, 20 και 23°C) κατά το εμβρυικό και λεκιθοφόρο στάδιο στην πλαστικότητα των ωτολίθων πειραματικών πληθυσμών τσιπούρας, από το τέλος του σταδίου της μεταμόρφωσης (56-58 μέρες μετά την εκκόλαψη, dph) έως το στάδιο του ιχθυδίου (93-95 dph). Επιπλέον, ελέγχθηκε η επίδραση του διαφορετικού περιβάλλοντος ανάπτυξης στη μορφολογία των ωτολίθων εκτρεφόμενων πληθυσμών τσιπούρας, από το στάδιο του ιχθυδίου (122 dph) έως το ενήλικο στάδιο (314-393 dph). Για την αξιολόγηση του SRD ως αξιόπιστο δείκτη στη διάκριση δραπετών ιχθυοκαλλιέργειας, ελέγχθηκε η εξέλιξη των επιπέδων SRD στους εκτρεφόμενους πληθυσμούς, από το στάδιο της μεταμόρφωσης έως το τέλος της σωματικής τους αύξησης.Η μελέτη της ποικιλομορφίας του σχήματος των ωτολίθων πραγματοποιήθηκε μέσω της ελλειπτικής Fourier ανάλυσης, ενώ η ανάλυση του σχήματος του σώματος έγινε με τη μέθοδο της γεωμετρικής μορφομετρίας. Για την εξέταση της ασυμμετρίας σε χαρακτήρες μεγέθους και σχήματος των ωτολίθων, χρησιμοποιήθηκε η διακύμανση της διαφοράς των δύο πλευρών του σώματος και η μέση απόλυτη τιμή της διαφοράς των δύο πλευρών. Για τις διαφορές μεγέθους των ωτολίθων, υπολογίστηκαν οι κανονικοποιημένες τιμές του μέγιστου μήκους, μέγιστου πλάτους, της επιφάνειας και της περιμέτρου. Οι διαφορές σχήματος μεταξύ των διαφορετικών γεωγραφικών ομάδων εξετάστηκαν μέσω της ανάλυσης διαχωρισμού CAP (Canonical Analysis of Principal Coordinates). Στην εξέταση των διαφορών του σχήματος (ωτολίθων και σώματος) μεταξύ των εκτρεφόμενων (δείγματα ελέγχου) και ατόμων που συλλέχθηκαν στο πεδίο, πραγματοποιήθηκε ανάλυση κανονικών μεταβλητών (Canonical variate analysis, CVA). Για το σύνολο των υπόλοιπων αναλύσεων, η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ των ομάδων εξετάστηκε μέσω της χρήσης παραμετρικών και μη παραμετρικών tests. Οι διαφορές ως προς τη γενετική ποικιλομορφία μεταξύ των ομάδων εξετάστηκαν μέσω του δείκτη γενετικής διαφοροποίησης (FST).Σύμφωνα με τα κύρια αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, ο έλεγχος της διακύμανσης του σχήματος των ωτολίθων και του σώματος στα άγρια άτομα (L30), αποκάλυψε 3 "φαινοτυπικά" αποθέματα, του Αιγαίου, του Ιονίου και της λιμνοθάλασσας του Μεσολογγίου. Εντούτοις, από τον έλεγχο της γενετικής ποικιλομορφίας, για τους συγκεκριμένους μοριακούς δείκτες, προέκυψε ένα γενετικά ενιαίο απόθεμα στον Ελλαδικό χώρο. Με την αύξηση της πιθανής συμμετοχής δραπετών ψαριών στα άτομα φυσικής προέλευσης (M30-60, M60), η μελέτη της διακύμανσης του σχήματος (σχήμα σώματος και ωτολίθων) δεν έδειξε ξεκάθαρη γεωγραφική διαφοροποίηση μεταξύ των ομάδων. Στις γεωγραφικές περιοχές όπου η συμμετοχή ψαριών με υψηλά επίπεδα SRD είναι μεγάλη, τα άτομα με υψηλή πιθανότητα να περιέχουν δραπέτες ιχθυοκαλλιέργειας (M60), εμφάνισαν σημαντικά μεγαλύτερη ασυμμετρία και μέγεθος ωτολίθων σε σχέση με τα άγρια (L30). Παρόλα αυτά, δεν υπήρξε σημαντική γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των ατόμων με διαφορετικά επίπεδα SRD εντός των διαφορετικών γεωγραφικών ομάδων. Τέλος, υπήρξε σημαντική διαφοροποίηση μεταξύ των εκτρεφόμενων και των ατόμων φυσικής προέλευσης ως προς τα μορφολογικά και τα γενετικά τους χαρακτηριστικά.Ο έλεγχος των ορίων φαινοτυπικής διακύμανσης στη τσιπούρα, έδειξε ότι το σχήμα και η ασυμμετρία των ωτολίθων από το στάδιο της μεταμόρφωσης έως το ιχθύδιο, άλλαξε σημαντικά ανάλογα με την θερμοκρασία πρώιμης ανάπτυξης των ατόμων. Επιπλέον, το σχήμα το μέγεθος και η ασυμμετρία των ωτολίθων διαφοροποιήθηκε σημαντικά ανάλογα με το περιβάλλον ανάπτυξης των ιχθυδίων και των ενήλικων ψαριών. Σύμφωνα με την εξέλιξη του SRD κατά την ανάπτυξη της τσιπούρας στις μονάδες καλλιέργειας, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το SRD αυξάνεται συνεχώς, από το στάδιο έναρξης της δημιουργίας των λεπιών (11,2 ± 5,7% μέσο SRD, 58 μέρες μετά την εκκόλαψη, dph, 2,0 cm τυπικό μήκος, SL) έως το τέλος της περιόδου σωματικής αύξησης των ατόμων (98,7 ± 3% έως 99,8 ± 0,9% μέσο SRD, 314-393 dph, 21,7-21,9 cm SL). Κατά την περίοδο μετάβασης από το εκκολαπτήριο στα κλουβιά πάχυνσης τα ψάρια παρουσιάζουν ένα μεγάλο εύρος SRD που κυμαίνεται από 40 έως 92% (122 dph, 5,1 cm SL).Η σημασία των αποτελεσμάτων σχολιάζεται ως προς την ταυτοποίηση των αποθεμάτων τσιπούρας, τη συσχέτιση του SRD με την ηλικία δραπέτευσης των ψαριών, τη διάκριση των εν δυνάμει δραπετών στα φυσικά αποθέματα, τις διαφορές μεταξύ άγριων και εκτρεφόμενων ατόμων και την πλαστικότητα των ωτολίθων κατά την διάρκεια της ανάπτυξης των ψαριών ως απόκριση στους διαφορετικούς περιβαλλοντικούς παράγοντες. Τα κύρια αποτελέσματα δείχνουν την ύπαρξη τριών "φαινοτυπικών" αποθεμάτων με όμοια γενετικά χαρακτηριστικά. Η μορφολογία των ωτολίθων είναι ένας έντονα πλαστικός χαρακτήρας και αποτελεί αξιόπιστο εργαλείο στη μελέτη της επίδρασης του περιβάλλοντος στη φυσιολογία των ψαριών. Τα ψάρια εκτροφής διαφέρουν από τα ψάρια φυσικής προέλευσης τόσο φαινοτυπικά όσο και μορφολογικά. Ο SRD αυξήθηκε συνεχώς με την ηλικία και ήταν ικανός δείκτης στη διάκριση δραπετών ψαριών με βάση τη μορφολογία. Ωστόσο, δεν ανέδειξε διαφορές στη γενετική σύσταση μεταξύ άγριων και πιθανώς διαφυγόντων ατόμων.