Ecophysiology of Salmonella stress response

Abstract

Salmonella spp. is a ubiquitous foodborne pathogen, with significant economical losses worldwide. With more than 2500 serotypes, this bacterium has evolved to survive under different environments and across multiple hosts. The ability of this pathogen to induce acid resistance mechanisms that help them better withstand severe acid stress following preculture to mild or moderate acid conditions can pose a major public threat, especially for ready-to-eat acid foods such as mayonnaise or deli-type salads. Αpart from increased acid resistance, stimulation of acid resistance mechanisms may also result in increased virulence. Although almost any food product can be contaminated with this pathogen, products of animal origin have been highly associated with the presence of Salmonella spp., with S. Typhimurium and S. Enteritidis being the most common serovars isolated from pig meat and eggs, respectively. The risk of contamination with Salmonella during all the farm-to-fork stages alongside with the emergence of resistance or multi-drug resistance pathogens raises considerable concerns, particularly in an era were the public demand for more natural foods with fewer chemical additives is increasingly growing.The main objectives of this thesis were (i) to screen the in vitro contribution of different levels of undissociated acetic acid over a range of different pH values in inducing acid resistance in S. Enteritidis and to further examine whether the in vitro results could be extrapolated in a food matrix, with regard to intrinsic and extrinsic food related factors (chapter 2), (ii) to assess the in situ adaptive responses of six Salmonella spp. strains in mayonnaise following adaptation to three acid conditions tested in chapter 2 and to further elucidate the role of pH and undissociated acetic acid in the phenotypic and transcriptomic adaptive profiles of two S. Enteritidis strains having the most prominent adaptive potential (chapter 3) and (iii) to assess the in vitro and in situ antimicrobial potential of plant aqueous extracts collected as by-products of essential oil production against three stains of S. Typhimurium (chapter 4).The results of chapter 2 clearly established a link between in vitro acid resistance and undissociated acetic acid concentrations following acid exposure to pH 2.5, though the pH of the adaptation medium seemed also to affect the induction of acid resistance. In addition, it was shown that factors prevailing on the subsequent in vitro (pH, temperature) or in situ (unspecified intrinsic food related factors) acid challenge may collectively determine the acid resistance phenotypes of the pathogen (chapter 2). In chapter 3, strain-dependent differences were found regarding the innate and adaptive responses of six Salmonella spp. strains inoculated in mayonnaise at 5oC. Differences were also found in the contribution of pH and undissociated acetic acid on the phenotypic and transcriptomic profiles of the two S. Enteritidis strains. With regard to the contamination potential of pork meat with S. Typhimurium, in chapter 4 the in vitro antimicrobial effect of aqueous plant by-products was screened against three strains of S. Typhimurium in pork meat. The antimicrobial activity was mainly plant and temperature dependent. In situ application of oregano aqueous plant extracts effectively reduced the levels of S. Typhimurium FS8 populations in pork meat stored at 4oC. In conclusion, induction of acid resistance mechanisms can potentially protect Salmonella against lethal acid environments, with regard to strain variations and factors prevailing during acid challenge and acid exposure. Natural antimicrobials can provide an effective, alternative, economical and eco-friendly way for ensuring meat safety.

Το βακτήριο Salmonella spp. είναι τροφιμογενές παθογόνο, με ευρεία παρουσία στο περιβάλλον. Οι οικονομικές συνέπειες και οι επιπτώσεις στην υγεία λόγω των τροφιμογενών λοιμώξεων από Salmonella spp. είναι παγκοσμίως σημαντικές. Το γένος Salmonella spp. περιλαμβάνει πάνω από 2500 οροτύπους και έχει τη δυνατότητα να επιβιώνει σε διαφορετικά περιβάλλοντα, προσβάλλοντας ένα μεγάλο εύρος ξενιστών. Η ικανότητα του παθογόνου Salmonella spp. να επάγει μηχανισμούς οξεοανθεκτικότητας μετά από προσαρμογή του σε ήπια ή μέτρια όξινες συνθήκες του επιτρέπουν να επιβιώσει σε ισχυρά όξινα περιβάλλοντα (στρες), διακυβεύοντας με τον τρόπο αυτό τη δημόσια υγεία. Ο κίνδυνος είναι ακόμα μεγαλύτερος όσον αφορά τα έτοιμα-προς κατανάλωση όξινα τρόφιμα, τα οποία δεν επιδέχονται κάποιο μεταχείριση πριν την κατανάλωση τους. Η προσαρμογή σε όξινες συνθήκες είναι ένα ιδιαίτερα περίπλοκο φαινόμενο που, εκτός από αυξημένη ανθεκτικότητα, προσδίδει στο βακτήριο και μεγαλύτερη παθογένεια. Αν και πρακτικά όλα τα τρόφιμα μπορούν να επιμολυνθούν από Salmonella, τα τρόφιμα ζωικής προέλευσης αποτελούν την κυριότερη αιτία σαλμονέλλωσης. Ο ορότυπος S. Typhimurium αποτελεί ένα από τους πιο συχνά απαντώμενους ορότυπους στο χοίρειο κρέας, ενώ η παρουσία του οροτύπου S. Enteritidis έχει συσχετισθεί κυρίως με αυγά ή προϊόντα με βάση τα αυγά. H επιμόλυνση των τροφίμων με Salmonella spp. μπορεί να γίνει σε όλα τα στάδια της διαδικασίας παραγωγής και επεξεργασίας μέχρι το τραπέζι του καταναλωτή (from farm to fork). Το γεγονός αυτό, σε συνδυασμό με την αύξηση των μικροοργανισμών ανθεκτικών σε ένα ή και περισσότερα αντιβιοτικά, δημιουργεί ισχυρές πιέσεις στη βιομηχανία τροφίμων, ιδιαίτερα σε μία εποχή όπου οι απαιτήσεις των καταναλωτών για πιο φυσικά προϊόντα με λιγότερα χημικά συντηρητικά ολοένα και μεγαλώνουν. Με βάση τα παραπάνω, οι κύριο στόχοι της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν: (i) να αξιολογήσει την in vitro επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων αδιάστατου οξικού οξέος προστιθέμενο σε ένα εύρος διαφορετικών τιμών pH στην επαγωγή όξινης ανθεκτικότητας του παθογόνου S. Enteritidis και να εξετάσει κατά πόσο τα αποτελέσματα από τα in vitro πειράματα μπορούν να επιβεβαιωθούν σε ένα τρόφιμο χαμηλού pH, λαμβάνοντας υπ’ όψιν παράγοντες που σχετίζονται με το εσωτερικό και εξωτερικό περιβάλλον του τρόφιμου (κεφάλαιο 2), (ii) να αξιολογήσει τους in situ αποκρίσεις έξι διαφορετικών στελεχών Salmonella spp. στη μαγιονέζα συντηρούμενη σε συνθήκες ψύξης (5 οC), μετά από την προσαρμογή τους σε τρεις διαφορετικές όξινες συνθήκες που επιλέχθηκαν με βάση τα in vitro αποτελέσματα του κεφαλαίου 2 και να προσδιορίσει το ρόλο του pH και του αδιάστατου οξικού οξέος στα φαινοτυπικά και μεταγραφικά προφίλ δύο επιλεγμένων στελεχών S.Enteritidis με το πιο αξιοσημείωτο δυναμικό προσαρμογής (κεφάλαιο 3) και, τέλος, (iii) να αξιολογήσει in vitro και in situ το αντιμικροβιακό δυναμικό διάφορων φυτικών υδατικών φάσεων, οι οποίες συλλέχθηκαν ως παραπροϊόντα της παραγωγής αιθέριων ελαίων, εναντίον τριών στελεχών S. Typhimurium. Τα αποτελέσματα του κεφαλαίου 2 έδειξαν ότι υπάρχει σχέση μεταξύ της in vitro οξεοανθεκτικότητας του παθογόνου S. Enteritidis και των συγκεντρώσεων του αδιάστατου οξικού οξέος κατά την έκθεση του μικροοργανισμού σε pH 2.5, με το pH του μέσου προσαρμογής να επηρεάζει επίσης την επαγωγή ή μη αυξημένης ικανότητας επιβίωσης. Επιπλέον, βρέθηκε ότι οι παράγοντες που επικρατούν στη μετέπειτα in vitro (pH, θερμοκρασία επώασης) ή in situ (μη καθορισμένοι παράγοντες του εσωτερικού περιβάλλοντος του τρόφιμου) καταπόνηση του παθογόνου μπορεί επιπρόσθετα να επηρεάσουν τις φαινοτυπικές αποκρίσεις. Στο κεφάλαιο 3, διαστελεχιακές διαφορές επηρέασαν την επαγόμενη (induced) και μη επαγόμενη (innate) ανθεκτικότητα έξι διαφορετικών στελεχών Salmonella spp. σε μαγιονέζα συντηρούμενη στους 5οC. Επιπλέον, βρέθηκε ότι το pH και το αδιάστατο οξικό οξύ επηρεάζουν διαφορετικά το φαινοτυπικό και μεταγραφικό προφίλ των δύο εξεταζόμενων στελεχών S. Enteritidis. Δεδομένου ότι η επιμόλυνση του χοίρειου κρέατος με S. Typhimurium είναι μεγάλη, στο κεφάλαιο 4 εξετάστηκε η in vitro αντιμικροβιακή δράση φυτικών υδατικών παραπροϊόντων σε τρία διαφορετικά στελέχη S. Typhimurium σε χοίρειο κρέας. Το αντιμικροβιακό δυναμικό των εξεταζόμενων φάσεων επηρεάστηκε κυρίως από τη θερμοκρασία επώασης και το είδος της υδατικής φάσεως που εξετάστηκε. Η in situ εφαρμογή των υδατικών φάσεων ρίγανης μείωσε αποτελεσματικά τους πληθυσμούς του παθογόνου S. Typhimurium FS8 σε χοίρειο κρέας συντηρούμενο στους 4οC. Συμπερασματικά, η επαγωγή των όξινων μηχανισμών ανθεκτικότητας μπορεί να προστατέψει το παθογόνο βακτήριο Salmonella spp. από τη θανατηφόρο επίδραση ισχυρά όξινων συνθηκών. Ωστόσο, η ενεργοποίηση ή όχι μηχανισμών επιβίωσης επηρεάζεται από τη διαστελεχιακή παραλλακτικότητα και από παράγοντες που επικρατούν τόσο κατά τη διάρκεια της διαδικασίας προσαρμογής όσο και κατά τη διάρκεια της όξινης καταπόνησης. Επιπλέον, οι φυσικές αντιμικροβιακές ενώσεις δύνανται να παρέχουν μια αποτελεσματική, οικονομική και οικολογική λύση για τη βελτίωση και διασφάλιση της ασφάλειας του κρέατος.