Μελέτη του ρόλου των σηματοδοτικών πορειών του NF-κΒ στην καρκινογένεση του πνεύμονα και στη ρύθμιση γονιδίων-στόχων τους

Abstract

Lung cancer is the most common type of cancer and the leading cause of cancer related deaths worldwide. It is clinically divided into non small cell lung cancer (NSCLC) and small cell lung cancer (SCLC) that account for ~85% and ~15% of all cases respectively. Lung adenocarcinoma (LUAD), the main histopathological subtype of NSCLC (~55%), develops in distinct steps involving oncogenic mutations that activate the canonical IKKβ-p65/p50 pathway. The canonical NF-κΒ pathway is normally involved in the regulation of pro-inflammatory and stress cellular responses, however it is found aberrantly activated in many cancer types, including NSCLC, promoting tumor growth. However, the molecular mechanisms that govern its role in lung cancer progression are not fully understood. On the contrary, the role of the non canonical NF-κB activation pathway, mediated through IKKα kinase, IKKα-RelB/p52 seems to either promote or inhibit tumor progression in different types of cancers while its role in lung cancer remains understudied. Importantly, both IKKα and ΙΚΚβ kinases can have independent functions of NF-κΒ activation. While IKKβ promotes NSCLC progression, the role of IKKα seems to be tumor suppressive in some types of cancer and tumor promoting in others, while its role in lung cancer progression is still unclear.The aim of the present study was the investigation of the role of both canonical and non-canonical NF-κB activation pathways in NSCLC progression and the identification of novel target genes and possible molecular pathways through which they mediate their effects. To study the role of non canonical NF-κB activation pathway in NSCLC we used human NSCLC cancer cell lines where we stably knocked-down either IKKα kinase or the p52 NF-κB subunit. The generated cell lines were subcutaneously inoculated in immune-compromised NSG mice to grow as in vivo xenografts. The results showed that while IKKα acts to suppress NSCLC growth, p52 subunits enhances tumor formation, and therefore IKKα in NSCLC acts as a tumor suppressor independently of NF-κB activation. These findings were also verified in a bi-transgenic in vivo mouse model where IKKα ablation in alveolar type II cells resulted in the formation of more tumors and of greater size in the mice lungs upon administration of the chemical carcinogen urethane. In order to study the molecular mechanism through which IKKα suppresses lung cancer development we performed RNA-seq analysis in RNA samples from the dissected tumors from both the bi-transgenic mice and the in vivo xenografts, so as to identify novel IKKα target genes. IKKα led to the downregulation of HIF-1α target genes including GAPDH, GPI, PFKL, SLC2A1 and HIGD2A. Our results identified an evolutionary conserved, tumor suppressive mechanism through which IKKα prevents stabilization and activation of HIF-1α transcription factor and subsequent activation of its target genes SLC2A1 και ΗΚ2 in vivo, therefore preventing cancer cell proliferation under hypoxia.To study the role of canonical NF-κB activation pathway in NSCLC, we knocked-down the NF-κΒ subunit RelA/p65 in NSCLC cell lines, which were then inoculated in immune-compromised mice and allowed to grow as in vivo xenografts. Downregulation of the RelA/p65 transcription factor resulted in significantly reduced tumor growth. Total RNA isolated from the tumors that developed, was subjected to RNA-seq analysis. Among the differentially expressed genes identified was the ROS1 proto-oncogene and the LGR6 receptor gene, whose expression was downregulated upon p65 knock-down, while the expression of the cell surface antigen CD82 that acts as a metastasis suppressor was found upregulated. RelA/p65 knock-down or CD82 overexpression was shown to suppress the epithelial-to-mesenchymal cell transition (EMT) by increasing the expression of E-cadherin, the critical marker of the epithelial cell phenotype. Our results showed that RelA/p65 acts to promote NSCLC development through promoting cancer cell migration and epithelial-to-mesenchymal-transition (EMT), at least in part, through downregulation of CD82 expression. Collectively, while IKKα suppresses NSCLC progression through inhibition of HIF-1α transcription factor activation and subsequent regulation of its target genes, the canonical NF-κΒ activation pathway IKKβ-RelA/p65 promotes tumor formation in vivo, in part through downregulation of the CD82 metastasis suppressor.

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η συχνότερη μορφή καρκίνου με την υψηλότερη θνησιμότητα παγκοσμίως. Κλινικά διακρίνεται στο μη-μικροκυτταρικό (NSCLC) και στο μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) που αντιπροσωπεύουν το ~85% και ~15% όλων των περιπτώσεων, αντίστοιχα. Το αδενοκαρκίνωμα του NSCLC, που αποτελεί τον κύριο ιστοπαθολογικό υπότυπο (~55%), οφείλεται στη συσσώρευση ογκογόνων μεταλλάξεων οι οποίες οδηγούν στην ενεργοποίηση της κανονικής σηματοδοτικής πορείας του NF-κΒ, ΙΚΚβ-p65/p50. Η πορεία αυτή, που φυσιολογικά εμπλέκεται στη ρύθμιση των προ-φλεγμονωδών και στρεσογόνων κυτταρικών αποκρίσεων, εμφανίζεται ιδιοστατικά ενεργή σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του NSCLC, προάγοντας την ανάπτυξη του όγκου. Ωστόσο, στο NSCLC οι μοριακοί μηχανισμοί δράσης της δεν έχουν αποσαφηνιστεί πλήρως. Ομοίως, ενώ η δράση της μη κανονικής πορείας ενεργοποίησης του NF-κΒ που επάγεται διαμέσου της κινάσης ΙΚΚα, ΙΚΚα-RelB/p52 γενικά προάγει την καρκινογένεση, στο NSCLC είναι ελάχιστα μελετημένη. Επιπλέον, οι κινάσες, ΙΚΚα και ΙΚΚβ, εμφανίζουν και ανεξάρτητες δράσεις από την ενεργοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων NF-κΒ. Ενώ η κινάση ΙΚΚβ προάγει την ανάπτυξη NSCLC, αντίθετα, ο ρόλος της κινάσης ΙΚΚα εμφανίζεται ογκοκατασταλτικός σε ορισμένους τύπους καρκίνου και ογκογόνος σε κάποιους άλλους, ενώ στον καρκίνο του πνεύμονα ο ρόλος της παραμένει ασαφής. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση του ρόλου της κανονικής και μη-κανονικής πορείας ενεργοποίησης του NF-κΒ στην ανάπτυξη του NSCLC αλλά και η ταυτοποίηση νέων γονιδίων στόχων που διέπουν τη δράση τους.Για τη μελέτη του ρόλου της μη-κανονικής πορείας στην καρκινογένεση του πνεύμονα χρησιμοποιήθηκαν καρκινικές κυτταρικές σειρές NSCLC στις οποίες μειορρυθμίστηκε η κινάση ΙΚΚα, ή η υπομονάδα NF-κΒ p52 και οι οποίες εμβολιάστηκαν υποδόρια αμφίπλευρα σε αθυμικούς μύες ως ξενομοσχεύματα in vivo. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι ενώ η κινάση ΙΚΚα καταστέλλει την ανάπτυξη του NSCLC, η υπομονάδα p52 προάγει την ανάπτυξή του, και επομένως ο ογκοκατασταλτικός ρόλος της ΙΚΚα είναι ανεξάρτητος από την ενεργοποίηση του NF-κΒ. Αυτά τα ευρήματα επιβεβαιώθηκαν και σε ένα δυ-διαγονιδιακό μοντέλο μυός in vivo όπου η απάλειψη της ΙΚΚα στα πνευμονοκύτταρα τύπου-ΙΙ είχε σαν αποτέλεσμα την αύξηση του αριθμού και του μεγέθους των όγκων στους πνεύμονες των διαγονιδιακών μυών μετά τη χορήγηση του χημικού καρκινογόνου ουρεθανίου. Για τη μελέτη του μηχανισμού δράσης της ΙΚΚα στην καρκινογένεση του πνεύμονα, πραγματοποιήθηκε ανάλυση RNA-seq σε δείγματα RNA από τους όγκους που απομονώθηκαν από τα ξενομοσχεύματα και τους όγκους που αναπτύχθηκαν στους διαγονιδιακούς μύες για την ταυτοποίηση γονιδίων-στόχων της ΙΚΚα. Η δράση της κινάσης ΙΚΚα είχε σαν αποτέλεσμα τη μείωση της έκφρασης γονιδίων-στόχων του μεταγραφικού παράγοντα HIF-1α, όπως είναι τα γονίδια GAPDH, GPI, PFKL, SLC2A1 και HIGD2A. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν έναν εξελικτικά συντηρημένο, ογκοκατασταλτικό μηχανισμό δράσης της ΙΚΚα στο NSCLC κατά τον οποίο η ΙΚΚα μειώνει τη σταθερότητα και την ενεργότητα του HIF-1α και τη μεταγραφή των γονιδίων-στόχων του SLC2A1 και ΗΚ2 in vivo, μειώνοντας την ικανότητα ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων σε συνθήκες υποξίας. Για τη μελέτη του ρόλου της κανονικής πορείας στην καρκινογένεση του πνεύμονα χρησιμοποιήθηκαν καρκινικές κυτταρικές σειρές NSCLC στις οποίες μειορρυθμίστηκε η υπομονάδα του NF-κΒ, RelA/p65 που ενεργοποιείται από την κινάση ΙΚΚβ και οι οποίες αναπτύχθηκαν ως ξενομοσχεύματα in vivo. Η αποσιώπηση του p65 είχε σαναποτέλεσμα την ανάπτυξη σημαντικά μικρότερων όγκων. Για την ταυτοποίηση γονιδίων-στόχων που μεταβάλλονται με τη δράση της κανονικής σηματοδοτικής πορείας του NF-κΒ πραγματοποιήθηκε ανάλυση RNA-seq σε δείγματα RNA από τους όγκους που απομονώθηκαν. Μεταξύ των γονιδίων που ταυτοποιήθηκαν ήταν το πρωτο-ογκογονίδιο ROS1 και το γονίδιο του υποδοχέα LGR6 η έκφραση των οποίων παρατηρήθηκε μειωμένη απουσία της υπομονάδας RelA/p65, ενώ αντίθετα αυξημένη παρατηρήθηκε η έκφραση του γονιδίου CD82/ΚΑΙ1, το οποίο κωδικοποιεί μια διαμεμβρανική τετρασπανίνη που δρα ως καταστολέας της μετάστασης. Η αποσιώπηση του RelA/p65 ή η υπερέκφραση του CD82 είχε σαν αποτέλεσμα την καταστολή της διαδικασίας της επιθηλιακής-προς-μεσεγχυματικής μετατροπής (EMT) διαμέσου της αύξησης των επιπέδων έκφρασης της Ε-καντερίνης που αποτελεί κύριο δείκτη του επιθηλιακού φαινοτύπου. Συνολικά, τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι η δράση του μεταγραφικού παράγοντα RelA/p65 στην ανάπτυξη του NSCLC προάγει τη μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων και τη διαδικασία της ΕΜΤ, εν μέρει, διαμέσου της μειορρύθμισης του CD82. Συμπερασματικά, ενώ η ΙΚΚα καταστέλλει την ανάπτυξη του NSCLC καταστέλλοντας την ενεργοποίηση του HIF-1α και των γονιδίων-στόχων του, η κανονική πορεία του NF-κΒ ΙΚΚβ - RelA/p65 προάγει την ανάπτυξη των όγκων in vivo, διαμέσου, μεταξύ άλλων, της μείωσης της έκφρασης του καταστολέα της μετάστασης CD82.