Αγγειογένεση και διεισδυτικότητα στα γλοιώματα

Abstract

Invasive tumors, including gliomas, utilize proteinases to degrade extracellular matrix components and diffuse into the adjacent tissues or migrate towards distant ones. In addition, proteinase activity is required for the formation of new blood vessels within the tumor. Levels of the proteinase matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) are highly increased in gliomas. In the present study, we examined the effect of the down-regulation of MMP-2 via adenovirus-mediated siRNA in gliomas. Here, we show that siRNA delivery significantly decreased levels of MMP-2 in the glioblastoma cell lines U-87 and U-251. U-87 and U-251 cells showed impaired invasion through matrigel as well as decreased migration from tumor spheroids. In addition, tumor-induced angiogenesis was decreased in in vitro experiments in cultured human endothelial cells (HMEC) and co-cultures of glioma cells with HMEC and VEGF excretion by tumor cells was reduced, whereas the addition of recombinant MMP-2 and VEGF significantly reversed the anti-angiogenic effect of the MMP-2 siRNA at the co-cultures. We also observed decreased angiogenesis in the in vivo dorsal skin-fold chamber model. After we applied irradiation at 10 Gray, MMP-2 was up-regulated by tumor cells and we observed an induction of tumor angiogenesis by approximately 10% at the co-cultures that the tumor cells were pre-irradiated. siRNA against MMP-2 efficiently inhibited the expression of MMP-2 in the irradiated tumor cells and blocked angiogenesis after irradiation in vitro. Down-regulation of MMP-2 interfered with the activity of intracellular signaling molecules and reduced phosphorylated levels of pI3K, pAKT and p38, even in the irradiated glioma cells, where we observed enhanced activity of p38. Moreover, MMP-2 inhibition induced apoptotic cell death in vitro, and suppressed tumor growth of pre-established U-251 intracranial xenografts in nude mice, whereas pre-infected with the adenovirus carrying the MMP-2 siRNA, U-251 glioblastoma cells failed to develop intracranial tumors after 6 weeks. Thus, specific targeting of MMP-2 may provide a novel, efficient approach for the treatment of gliomas and may contribute to the improvement of the poor outcomes of patients with these brain tumors.

Οι έντονα διεισδυτικοί όγκοι, συμπεριλαμβανομένων των γλοιοβλαστωμάτων, χρησιμοποιούν πρωτεϊνάσες για να αποικοδομήσουν τα συστατικά του εξωκυττάριου υποστρώματος και να διηθήσουν τους παρακείμενους ιστούς ή να μεταναστεύσουν προς απομακρυσμένους. Επιπλέον, η δραστηριότητα των πρωτεϊνασών είναι απαραίτητη για το σχηματισμό των νεόπλαστων αιμοφόρων αγγείων στο εσωτερικό του όγκου. Τα επίπεδα της μεταλλοπρωτεϊνάσης του διάμεσου υποστρώματος-2 (MMP-2) ανιχνεύονται αυξημένα στα γλοιώματα. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την επίδραση της καταστολής της MMP-2 στα γλοιοβλαστώματα, μέσω της αδενοϊικής μεταφοράς siRNA. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων φανερώνουν ότι οι κυτταρικές σειρές γλοιωβλατώματος U-87 και U-251 που διαμολύνθηκαν με το αδενοϊικό κατασκεύασμα-μεταφορέα των siRNA εμφάνισαν σημαντική μείωση των επιπέδων της MMP-2. Τα U-87 και U-251 κύτταρα παρουσίασαν μειωμένη διεισδυτικότητα διαμέσου του συστατικού των βασικών μεμβρανών matrigel, όπως επίσης και μείωση της απόστασης της μετανάστευσης τους από κυτταρικά σφαιρίδια. Επιπρόσθετα, περιορίστηκε σημαντικά η πυροδοτούμενη από τον όγκο αγγειογένεση σε in vitro πειράματα με καλλιέργειες ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων (HMEC) και σε συν-καλλιέργειες κυττάρων γλοιοβλαστώματος με HMEC και μειώθηκε σημαντικά η έκκριση του VEGF από τα καρκινικά κύτταρα, ενώ η προσθήκη στις καλλιέργειες ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης MMP-2 ή VEGF αξιοσημείωτα ανέστρεψε την αντι-αγγειογενετική επίδραση των MMP-2 siRNA. Επίσης, παρατηρήσαμε μείωση της αγγειογένεσης στο in vivo πρότυπο μελέτης του δέρματος της ράχης-κυτταρικού θαλάμου. Μετά από την εφαρμογή ακτινοβολίας σε δόση 10 Gray, αυξήθηκε σημαντικά η έκκριση MMP-2 πρωτεΐνης από τα καρκινικά κύτταρα και διαπιστώσαμε επαγωγή της πυροδοτούμενης από τον όγκο αγγειογένεσης κατά 10% περίπου στις συν-καλλιέργειες στις οποίες είχε προηγηθεί ακτινοβόληση των καρκινικών κυττάρων. Τα siRNA εναντίον της MMP-2 αποτελεσματικά κατέστειλαν την έκφραση της MMP-2 στα κύτταρα που είχαν ακτινοβοληθεί και απέτρεψαν την πυροδοτούμενη από την ακτινοβολία αγγειογένεση in vitro. Ακόμη, η καταστολή της MMP-2 εμφάνισε αλληλεπίδραση με την ενεργότητα των ενδοκυττάριων μορίων σήματος και μείωσε τα επίπεδα των φωσφορυλιωμένων μορίων pI3K, pAKT και p38, ακόμη και μετά την ακτινοβόληση των κυττάρων, η οποία παρατηρήσαμε ότι ενεργοποιεί το μόριο p38. Επιπλέον, η καταστολή της MMP-2 είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγή της απόπτωσης των κυττάρων γλοιοβλαστώματος in vitro και κατέστειλε την ανάπτυξη προ-εγκατεστημένων U-251 ενδοκράνιων όγκων σε αθυμικά ποντίκια, ενώ προ-διαμολυσμένα U-251 κύτταρα γλοιοβλαστώματος με τον αδενοϊό που μεταφέρει MMP-2 siRNA απέτυχαν να δημιουργήσουν ενδοκράνιους όγκους μετά από 6 εβδομάδες. Έτσι, η εξειδικευμένη στόχευση της MMP-2 μπορεί να αποτελέσει μία νέα, αποτελεσματική προσέγγιση για τη θεραπεία των γλοιοβλαστωμάτων και να συνεισφέρει στη βελτίωση της φτωχής πρόγνωσης των ασθενών με αυτή τη νόσο.