Μελέτη της έκφρασης και του βιολογικού ρόλου των μορίων συνάφειας (integrins, cadherins) στα ωάρια και έμβρυα ποντικών μετά από υπερδιέγερση ωοθηκών και η επίδραση της L-carnitine

Abstract

Despite the improvements in technology and know-how in human assisted reproduction, pregnancy rates remain low due to an imbalanced interaction between the embryo and the uterus upon ovarian stimulation. The normal reproductive process is controlled by a set of interactions that take place either among cells or between cells and the extracellular matrix (ECM). Such interactions involve cells, ligands, cell adhesion molecules, adhesion molecules that mediate cell-to-cell and cell-to-ECM interactions, as well as their receptors. The most important groups of these receptors are integrins and cadherins, which are characterized as adhesion molecules located on the cell surface. Integrins are a family of cell surface glycoprotein receptors that are involved in both intercellular and extracellular molecule binding, thereby allowing the organization of cells and tissues. From invertebrates to vertebrates, integrins and cadherins have been shown to play an important role in fertilization, embryo development and placentation. Specifically in mammals, ECM interactions with the epithelium hosting each embryonic stage play a critical role in the fate of the developing embryo, its ability to migrate to the uterus, to implant and grow until birth. This study presents new data on the involvement of adhesion molecules in the reproductive process. In order to investigate the role of cellular interactions with extracellular space molecules in the reproductive process, we studied the effect of the ovarian stimulation protocol and embryo biopsy on the expression of fetal integrins and cadherins, as well as their possible regulation of expression in the presence of L-carnitine (L-Cn). We focused on the expression of the integrins avb3, α5b1, av, α6b1 and E-cadherin in zygotes and different stages of embryos grown in vitro or isolated directly from the animal in vivo. Only the in vivo developing embryos showed a specific and polarized distribution of these molecules, indicating their possible successful interaction with the endometrium. The results presented in this study showed that an embryo that is considered to be healthy, according to the morphological criteria by microscopic observation, may be unsuitable for implantation due to the abnormal expression of adhesion molecules. The observation that fetal biopsy reduces the expression of adhesion molecules, most likely due to the invasive nature of the technique, could explain the failure of morphologically and genetically healthy embryos to implant. The addition of L-Cn to the embryonic culture medium, as a powerful energy generating factor, has been shown to enhance the expression of adhesion molecules in pre-implantation embryos, simulating thus the in vivo phenotype of adhesion molecules in the developing embryos, which is important for the acquisition of early embryo polarisation. Early polarity determines the subsequent development of the embryo and its successful implantation. Within the organism, such polarity is dictated by the tubal epithelial cells through interactions with the adhesion molecules, which is not observed in the in vitro developing embryos. Further development of the technology could provide biomimetic surfaces resembling the tubal environment, thereby providing a natural developmental environment for the embryos, and thus an improved embryo implantation outcome.

Παρά τις βελτιώσεις της τεχνολογίας και της τεχνογνωσίας στην υποβοηθούμενη αναπαραγωγή στον άνθρωπο, τα ποσοστά εγκυμοσύνης παραμένουν χαμηλά λόγω της ανισορροπίας αλληλεπίδρασης εμβρύου και μήτρας μετά από διέγερση των ωοθηκών. Η φυσιολογική αναπαραγωγική διαδικασία ελέγχεται από ένα σύνολο αλληλεπιδράσεων που πραγματοποιούνται είτε μεταξύ των κυττάρων, είτε μεταξύ των κυττάρων και των στοιχείων της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (ΕΘΟ). Στις κυτταρικές αυτές αλληλεπιδράσεις εμπλέκονται κύτταρα, συνδετικά μόρια, μόρια προσκόλλησης των κυττάρων μεταξύ τους και μόρια προσκόλλησης που μεσολαβούν στις αλληλεπιδράσεις του κυττάρου με στοιχεία της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, καθώς και τους υποδοχείς αυτών. Η πιο σημαντική ομάδα αυτών των υποδοχέων είναι οι ιντεγκρίνες και οι καδερίνες, οι οποίες χαρακτηρίζονται ως μόρια συνάφειας που βρίσκονται στην επιφάνεια των κυττάρων. Οι ιντεγκρίνες είναι μια οικογένεια γλυκοπρωτεϊνικών υποδοχέων της κυτταρικής επιφάνειας που εμπλέκονται τόσο στις διακυτταρικές συνδέσεις όσο και στις συνδέσεις με μόρια του εξωκυττάριου χώρου, επιτρέποντας έτσι την οργάνωση των κυττάρων και των ιστών. Από τα ασπόνδυλα έως τα σπονδυλωτά, οι ιντεγκρίνες και οι καδερίνες έχουν αποδειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη γονιμοποίηση, την ανάπτυξη των εμβρύων και την πλακουντοποίηση. Ειδικά στα θηλαστικά, οι αλληλεπιδράσεις ΕΘΟ με το επιθήλιο που φιλοξενεί κάθε εμβρυϊκό στάδιο διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στην τύχη του αναπτυσσόμενου εμβρύου, την ικανότητά του να μεταναστεύει στη μήτρα, να εμφυτευτεί και να αναπτυχθεί μέχρι τη γέννηση. Στην παρούσα μελέτη παρουσιάζονται νέα δεδομένα για την συμμέτοχη των μορίων συνάφειας στην αναπαραγωγική διαδικασία. Στο πλαίσιο της διερεύνησης του ρόλου των κυτταρικών αλληλεπιδράσεων με τα μόρια του εξωκυττάριου χώρου κατά την αναπαραγωγική διαδικασία μελετήσαμε την επίδραση του πρωτόκολλου διέγερσης των ωοθηκών και της βιοψίας εμβρύου στην εμβρυική έκφραση των ιντεγκρινών και καδερινών, καθώς και την πιθανή ρύθμιση της έκφραση αυτών παρουσία της L-καρνιτίνης (L-Cn). Επικεντρωθήκαμε στην έκφραση των ιντεγκρινών αvb3, α5b1, αv, α6b1και της E-καδερίνης σε ζυγώτες και διαφορετικά στάδια εμβρύων που αναπτύχθηκαν σε in vitro συνθήκες καλλιέργειας ή απομονώθηκαν απευθείας από το ζώο in vivo. Μόνο τα in vitro αναπτυσσόμενα έμβρυα εμφάνισαν συγκεκριμένη και πολωμένη κατανομή αυτών των μορίων, υποδεικνύοντας την πιθανή επιτυχή αλληλεπίδρασή τους με το ενδομήτριο. Τα αποτελέσματα που παρουσιάστηκαν σε αυτή τη μελέτη κατέδειξαν ότι το έμβρυο που θεωρείται υγιές σύμφωνα με τα μορφολογικά κριτήρια με μικροσκοπική παρατήρηση, μπορεί να είναι ακατάλληλο για εμφύτευση λόγω της μη φυσικής έκφρασης των μορίων συνάφειας. Η παρατήρηση ότι η βιοψία των εμβρύων μειώνει την έκφραση των μορίων συνάφειας πιθανότατα λόγου του επεμβατικού χαρακτήρα της τεχνικής θα μπορούσε να εξηγήσει την αποτυχία εμφύτευσης μορφολογικά και γενετικά υγιών εμβρύων. H προσθήκη της L-Cn στο μέσο εμβρυϊκής καλλιέργειας, ως παράγοντα παροχής ενέργειας, έδειξε ότι εντείνει την έκφραση μορίων συνάφειας στα προεμφυτευτικά έμβρυα, προσομοιάζοντας τον in vivo φαινότυπο έκφρασης μορίων συνάφειας των αναπτυσσόμενων εμβρύων, γεγονός το οποίο είναι σημαντικό για την ανάπτυξη της πρώιμης πολικότητας. Η πρώιμη πολικότητα καθορίζει την επακόλουθη ανάπτυξη του εμβρύου και την επιτυχή εμφύτευση του. Στον οργανισμό, αυτή η πολικότητα υπαγορεύεται από τα κύτταρα του επιθηλίου της σάλπιγγας μέσω αλληλεπιδράσεων με τα μόρια συνάφειας, γεγονός που δεν παρατηρείται στα in vitro αναπτυσσόμενα έμβρυα. Περαιτέρω ανάπτυξη της τεχνολογίας θα μπορούσε να προσφέρει βιομιμητικές επιφάνειες ικανές να προσομοιάσουν το κροσσωτό περιβάλλον της σάλπιγγας, παρέχοντας έτσι ένα φυσικό περιβάλλον ανάπτυξης για τα έμβρυα, και συνεπώς μια βελτιωμένη έκβαση εμφύτευσης των εμβρύων.