Συγκριτική μελέτη της κλινικοεργαστηριακής εξέτασης και της παθολογοανατομικής διερεύνησης του εγκεφάλου παρήλικων σκύλων με ή χωρίς κλινική εικόνα γνωστικής δυσλειτουργίας (άνοια)

Abstract

Canine cognitive dysfunction syndrome (CCDS) is a progressive neurodegenerative disease, that is highly prevalent in old dogs but critically underreported. CCDS models early Alzheimer disease. To date, no specific multi-targeted protocol exists for the diagnosis of the disease and many key aspects of the syndrome are not elucidated. The aim of this study was firstly to comprehensively quantify Aβ42 and Aβ40 peptides in blood and CSF and to investigate their contribution in the improvement of CCDS individual’s characterization. Secondly, through the histopathological and immunohistochemical investigation of these brains of interest, we aim to validate the above measurements as prominent biomarkers of CCDS, as pathology is considered as the “gold standard” for the credibility rating of candidate biomarkers. A total of 61 dogs were assigned to four groups: i) Young (YG) ii) Middle-aged (MA) iii) Cognitively Unimpaired and Aged (CU) iv) Cognitively Impaired and Aged (CI). Animal’s cognitive status was assessed using Canine Cognitive Assessment Scale modified by the Companion Animal Welfare Education Center. Based on the scale score the CI group was further subdivided in dogs with Mild Cognitive Impairment (CI-MCI) and in dogs with Severe Cognitive Impairment (CI-SCI). Direct and indirect Aβ markers were determined in plasma fractions (total-TP, free-FP, bound to plasma components-CP) and CSF using AΒtest assays (Araclon Biotech). The dogs of the study died either naturally or were euthanized due to debilitating disorders and their brains were collected. The brains were routinely fixed, and samples were collected from: 1) prefrontal cortex 2) frontal lobe and caudate nucleus 3) parietal lobe 4) temporal lobe, piriform lobe and diencephalon 5) temporal lobe and hippocampus and 6) occipital lobe. Histopathological and immunohistochemical (Aβ40, Αβ42, p-tauSer396, ApoE4, GFAP) examination of paraffin wax-embedded brain sections were performed. A semiquantitative scoring system was used for the evaluation of the immunohistochemical findings. ΤP42 and CP42 levels were significantly higher in CI-MCI dogs when compared to CU and CI-SCI dogs. CSFAβ42 levels in YG were the lowest and were higher in CU than in CI dogs. CSF Aβ42 levels were correlated only with CPAβ42 and the CPAβ40. TPAβ42/40 allowed discrimination between CI-MCI and CU aged dogs. Positive labelling for Aβ40, Αβ42, p-tau and ApoE4 was detected in the brain of CU and CI aged dogs. In CU and MCI dogs, the fraction ΤΡ42 proved to be the most sensitive for the prediction of the Aβ42 brain depositions, the fraction ΤP42/40 was the most appropriate for the detection of early p-tau depostitions and the fraction CP42 was the most useful biomarker for the prediction of the overall of the p-tau depositions. We conclude that the role of p-tau protein on CCDS should be reconsidered. TP42/40 could generate, in the earliest phase of the symptoms, a new recruitment strategy for efficient preselection in the population of interest. The determination of a combination of CSF and plasma markers (TP42/40, ΤP42, CP42, CP42/40 and CSF42) on a large scale could serve a comprehensive role in a manifold approach of the disease, especially in the early stages

Το σύνδρομο γνωστικής δυσλειτουργίας του σκύλου (CCDS) είναι ένα προοδευτικά εξελισσόμενο νευροεκφυλιστικό νόσημα, το οποία εάν και είναι συχνό στους παρήλικους σκύλους, είναι σημαντικά υποδιαγνωσμένο. Το CCDS έχει πολλές ομοιότητες με το πρώιμο στάδιο της νόσου Alzheimer. Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχει ειδικό πολυπαραμετρικό πρωτόκολλο για τη διάγνωση της νόσου και πολλές βασικές πτυχές του συνδρόμου δεν έχουν διασαφηνιστεί. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν: πρώτον, ο ποσοτικός προσδιορισμός των πεπτιδίων Αβ42 και Αβ40, στο αίμα και το εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ) και η διερεύνηση της συμβολής αυτών στη διάγνωση σκύλων με CCDS. Δεύτερον, η επιβεβαίωση της κλινικής διάγνωσης καθώς και η επικύρωση της αξιοπιστίας των παραπάνω παραμέτρων ως βιοδείκτες του CCDS, μέσω της ιστοπαθολογικής και ανοσοϊστοχημικής διερεύνησης των εγκεφάλων των σκύλων της μελέτης, αφού, η παθολογοανατομική διερεύνηση αποτελεί τη μέθοδο εκλογής για την αξιολόγηση της αξιοπιστίας ενός βιοδείκτη. Στη μελέτη συμμετείχαν 61 σκύλοι χωρισμένοι σε τέσσερις ομάδες: i) Νεαροί (Υoung-YG, 0-4 ετών) ii) Μέσης Ηλικίας (Middle Aged, MA, 4-8 ετών) iii) Γνωστικά υγιείς παρήλικοι (Cognitive unimpaired-CU, >8 ετών) iv) Παρήλικοι με γνωστικές διαταραχές (Cognitive Impaired-CI, >8 ετών). Για την αξιολόγηση του γνωστικού προφίλ των παρήλικων σκύλων χρησιμοποιήθηκε βαθμολογική κλίμακα με τη μορφή ερωτηματολογίου που πρέπει να απαντάται από τον κηδεμόνα του κάθε ζώου. Με βάση τη βαθμολογία της κλίμακας, η ομάδα των CI παρήλικων σκύλων διακρίθηκε σε δύο υποομάδες: 1) Σκύλοι με ήπια γνωστική διαταραχή (Mild Cognitive Impairment, MCI) 2) Σκύλοι με σοβαρή γνωστική διαταραχή (Severe Cognitive Impairment, SCI). Tα επίπεδα των Αβ40 και Αβ42 προσδιορίστηκαν σε τρία κλάσματα του πλάσματος (ολικό στο πλάσμα-ΤΡ, ελεύθερο στο πλάσμα-FΡ, δεσμευμένο σε συστατικά του πλάσματος-CP) και στο ΕΝΥ χρησιμοποιώντας δύο επικυρωμένες δοκιμές (AΒtest, Araclon Biotech). Από τους σκύλους της μελέτης συλλέχθηκαν οι εγκέφαλοι. Οι εγκέφαλοι μονιμοποιούνταν σε διάλυμα φορμόλης 10% και στη συνέχεια, από κάθε εγκέφαλο λαμβάνονταν ιστοτεμάχια από όλες τις ανατομικές περιοχές ενδιαφέροντος. Ακολούθως, σε τομές παραφίνης έγινε ιστοπαθολογική και ανοσοϊστοχημική (Αβ40, Αβ42, p-tauSer396, ApoE4 και GFAP) διερεύνηση. Τα επίπεδα των ΤP42 και CP42 ήταν σημαντικά υψηλότερα στους ΜCI σκύλους σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες των παρήλικων σκύλων. Τα επίπεδα του Αβ42 στο ΕΝΥ συσχετίστηκαν μόνο με το κλάσμα CP42 και το CP40. Ο ΤΡ42/40 επέτρεψε τη διάκριση των CU από τους MCI σκύλους. Στους CU και ΜCI σκύλους, ο ΤΡ42 ήταν ο πιο ευαίσθητος για να τεθεί υποψία παρουσίας εναποθέσεων του Αβ42 στον εγκεφάλο. Ο ΤΡ42/40 ήταν ο καταλληλότερος για την ανίχνευση πρώιμων εναποθέσεων της p-tau και ο CP42 ήταν ο πιο χρήσιμος για την εκτίμηση της συνολικής εναπόθεσης της p-tau πρωτεΐνης. Συμπερασματικά, ο ρόλος της p-tau στην παθογένεια του CCDS θα πρέπει να επανεξεταστεί. Ο βιοδείκτης TP42/40 μπορεί να δημιουργήσει, μια νέα στρατηγική εντόπισης των παρήλικων σκύλων που εμφανίζουν περισσότερες πιθανότητες να νοσήσουν, ανεξαρτήτως της διακριτικής ικανότητας του κηδεμόνα τους. Η συνδυαστική αξιολόγηση μιας ομάδας βιοδεικτών ( TP42/40, ΤP42, CP42, CP42/40 στο πλάσμα και του Aβ42 στο ΕΝΥ ) σε μεγάλη κλίμακα θα μπορούσε να αποτελέσει χρήσιμο εργαλείο για την πρώιμη διάγνωση και τον ακριβή ορισμό των αρχικών σταδίων του CCDS.