In vitro αλληλεπιδράσεις της τιγεκυκλίνης με μεροπενέμη, κολιστίνη, γενταμικίνη και φωσφομυκίνη έναντι στελεχών Klebsiella pneumoniae που παράγουν KPC καρβαπενεμάσες: συγκριτική εκτίμηση 4 μεθόδων

Abstract

Carbapenem resistant K. pneumoniae admittedly represents a contemporary public health threat. This form of resistance is primarily caused by class A, B or D carbapenemases. These enzymes are highly transmissible via mobile genetic elements such as plamids, and therefore manifest a high potential to cause outbreaks, particularly across health care facilities. Their global prevalence has consequently reached alarming rates. In Greece, carbapenem resistant K. pneumoniae prevalence has exceeded 50%, according to recent data. Unfortunately, resistance does not only affect carbapenems and subsequently virtually all b-lactams, but because of additional resistance mechanisms that are co-carried by these isolates, it expands to many other antibiotic classes. Very few antibiotics remain variably active, such as colistin, tigecycline, gentamycin and fosfomycin and even these seem to suffer a decreasing level of effectiveness, as resistance is reported at a growing rate. The recently implemented combinations of ceftazidime/avibactam and meropenem/vaborbactam seem to constitute promising options, but clear in vivo evidence is lacking and early resistance reports are of concern, while they are inactive against class B carbapenemases. Misfortunes do not end here. Infections caused by carbapenem resistant K. pneumoniae isolates primarily affect vulnerable patients severely ill, either chronically or acutely, or else debilitated with multiple comorbidities. Risk factors for initial colonization and subsequent infection from CRKP have been well established by multiple researchers and are all associated with compromised states of health, namely admission in Intensive Care Units, need of mechanical ventilation, use of central catheters or other invasive procedures, diabetes mellitus, malignancy, chemotherapy, prior multiple antibiotic use, poor functional status and extended length of hospital stay. Given their critical condition, treatment should be prompt and highly effective. Instead, it is compromised by the limited therapeutic options. Hence, very high mortality ensues, resulting primarily from bacteraemias due to said isolates. Despite the ongoing battle of clinicians against such infections, there has been no consensus as to which is the indicated treatment strategy. Even though high quality evidence, in the form of randomized control trials, is lacking, there is data derived from several large scale retrospective studies which clearly supports combination therapy for these infections, claiming an association with lower mortality, particularly for patients at a high risk of death. Combination therapy seems to be the preferred approach by most experts, in the hope of achieving a result more favorable than the one expected by monotherapy. Combined antimicrobials might act additively, indifferently or even antagonistically to one another. The best scenario is for them to act synergistically, generating an effect greater than the sum of their individual activities. In the era of limited or even absent therapeutic options, a synergistic antimicrobial combination might prove important for the clinician. Given the frequency at which combination therapy is employed for the treatment of resistant infections, as well as the expectations clinicians have placed upon it, a reliable and accurate method able to predict the efficacy of a specific combination would be invaluable. Although there is no definite gold standard synergy testing method, the two most common ones through literature are the Time Kill and the Checkerboard methods, neither of which is available for routine use in the clinical microbiology laboratory, due to their laborious nature. A method as reliable, but also easily performed in any laboratory, would be expedient, in that it would permit routine combination testing against strains isolated from patients. In this context, this study assessed dual combinations of some of the last resort drugs against K. pneumoniae isolates producing carbapenemases of various stypes, namely combinations of tigecycline with either colistin, gentamicin, fosfomycin or meropenem. The Time Kill and Checkerboard nethods were employed, along with three different Etest methodologies, in order to determine whether one of the latter - much easier and simpler to perform - might prove suitable to replace the former. To that end, the Time Kill was used as a reference method, being considered by many to provide the most useful information from a clinical point of view, while it remains the sole standarised method for laboratory synergy testing. According to the reference method, synergy was found for 11% of all combinations tested. The most synergistic one was that of tigecycline and colistin at a rate of 25%, followed by the one with gentamicin at 10%, meropenem at 8% and fosfomycin at 4.5%. These findings are in line with published research data on the activity of tigecycline in combination with other agents against carbapenem resistant K. pneumoniae, which show that when combined with colistin, tigecycline is significantly more effective than either agent alone in Time-Kill assays. This combination has also demonstrated a synergistic effect with the checkerboard method, which in this study reached 45%. There also exist sporadic synergy reports with fosfomycin and gentamicin, as also noted in the present study. In the latter, the checkerboard method produced in total a higher synergy rate of 26.5%, while the Etest methods rates ranged from 2 to 47%. The “strictest” result was generated by the Cross Formation Etest method. The ultimate goal of the present study was to determine the degree of concordance between the reference and possible alternative methods. Despite the considerable rates of observed agreement between TKA and the rest of the methods tested, which ranged from 50% to 85%, analysis by Cohen’s kappa statistics revealed an almost nonexistent statistical correlation between them. There was one solitary exception, that of perfect statistical agreement between the reference and the cross formation Etest method for the combination of tigecycline with fosfomycin. Exploring correlations further than the Time Kill, there was only a fair agreement between two of the Etest methods with the checkerboard method. Looking at published studies comparing synergy testing methods against a variety of resistant gram-negative microorganisms, one can find rates of concordance which vary greatly, from 0% to 100%, which in fact represents the highest possible variability. This is not surprising if a number of parameters adhering to the nature of each method is to be considered. Most importantly, the methods involved bear different endpoints. Thus, the Time Kill assay measures the rate of bacterial killing, whereas the checkerboard and Etest methods, the inhibition of bacterial growth. Furthermore, the Time Kill evaluates killing over time, while the rest determine results at a fixed time point. It also uses specific agent concentrations, unchanged throughout the assay, whereas the rest assess optimal inhibition concentrations of the agents tested. The present study might indeed reflect these differences between the Τime Κill and Checkerboard/Etest methods, as it yielded poor agreement between the former and the latter, but detected a fair one between the two out of three Etest methods and the checkerboard. Further insight into the comparability of synergy testing methods reveals additional confounding factors, such as reproducibility issues, particularly for the checkerboard technique. On another note, each researcher may or may not evaluate parameters such as synergy at time points other than the 24 hours for the time kill assay, or the expression of additive, alongside synergistic, actions. Finally, there is an infinite variety of combinations of different drug concentrations acting on strains of different qualities, such as resistanse or sensitivity to the former, and with individual resistance mechanisms. Such considerations imply that there is a need for optimization and standardization of in vitro combination studies. Still, and in light of the absence of a true gold standard for synergy, it would be difficult to discern which of these methods provides the most reliable and accurate results. The optimal way to find out would be to correlate their findings with clinical outcomes, so as to obtain clinical evidence to support their validity. Such validation, in the form of ramdomised controlled trials, is almost nonexistent throughout current literature. It seems that outcome-based studies are urgently needed so as to throw light on the matter of antimicrobial synergy testing.

Μια από τις πιο ανησυχητικές μορφές αντιμικροβιακής αντοχής είναι η αντοχή στις καρβαπενέμες, κυρίως αυτή που παρατηρείται σε εντεροβακτηριακά, όπως σε στελέχη K. pneumoniae. Ο κύριος μηχανισμός της μορφής αυτής αντοχής είναι η παραγωγή καρβαπαπενεμασών, κυρίως των τάξεων Α, Β και D. Τα ένζυμα αυτά έχουν την ιδιότητα να διασπείρονται εύκολα μέσω κινητών γενετικών στοιχείων, όπως τα πλασμίδια, με αποτέλεσμα να προκαλούν επιδημικές εξάρσεις, κυρίως ενδονοσοκομειακές, από στελέχη που τα φέρουν. Τα επιδημιολογικά στοιχεία που αφορούν την παγκόσμια εξάπλωσή τους είναι ιδιαίτερα ανησυχητικά. Στη χώρα μας τα τελευταία επίσημα στοιχεία δείχνουν επιπολασμό διεισδυτικών στελεχών K. pneumoniae με αντοχή στις καρβαπενέμες που υπερβαίνει το 50%. Δυστυχώς, η αντοχή δεν αφορά μόνον τις καρβαπενέμες, αλλά και σχεδόν όλες τις τάξεις αντιβιοτικών, εξαιτίας επιπρόσθετων μηχανισμών αντοχής που συνυπάρχουν στα στελέχη αυτά. Πολύ λίγα αντιβιοτικά διατηρούν, κατά περίπτωση, άλλοτε άλλη δραστικότητα, όπως η κολιστίνη, η τιγεκυκλίνη, η γενταμικίνη και η φωσφομυκίνη, ενώ ακόμη και σε αυτά υπάρχουν αυξανόμενες αναφορές αντοχής. Οι νέοι συνδυασμοί κεφταζιδίμης/αβιμπακτάμης και μεροπενέμης/βαμπορμακτάμης είναι πολλά υποσχόμενοι, αλλά σαφής in vivo απόδειξη της χρησιμότητάς τους ακόμη δεν υπάρχει, ενώ είναι ανενεργοί για τα στελέχη που παράγουν καρβαπενεμάσες τύπου MBL. Επιπλέον, υπάρχουν ήδη πρώιμες αναφορές αντοχής και σε αυτούς. Οι δυσκολίες δε σταματούν εδώ. Οι λοιμώξεις που προκαλούνται από στελέχη K. pneumoniae ανθεκτικών στις καρβαπενέμες δυστυχώς επηρεάζουν κυρίως τους πιο ευάλωτους ασθενείς, αυτούς που είναι σοβαρά άρρωστοι, οξέως είτε χρονίως, ή φέρουν πολλαπλές συννοσηρότητες. Οι παράγοντες κινδύνου αρχικού αποικισμού τους και συνεπακόλουθης νόσησης έχουν πλήρως διερευνηθεί και όλοι σχετίζονται με επιβαρυμένη υγεία, όπως νοσηλεία σε Μονάδα Εντατικής Θεραπείας, ανάγκη μηχανικού αερισμού, καθετήρων ή άλλων επεμβατικών διαδικασιών, σακχαρώδη διαβήτη, κακοήθεια, χημειοθεραπεία, προηγούμενη λήψη αντιβιοτικών, κακή γενική κατάσταση και μακρά παραμονή στο νοσοκομείο. Τέτοιοι άρρωστοι χρήζουν άμεσης και αποτελεσματικής θεραπείας. Σε περίπτωση που νοσήσουν από τα εν λόγω στελέχη, τούτο γίνεται εξαιρετικά δυσχερές. Ως αποτέλεσμα, οι επακόλουθες λοιμώξεις, και κυρίως οι βακτηριαιμίες, σχετίζονται με πολύ ψηλή θνητότητα. Η ενδεδειγμένη θεραπεία δεν έχει ακόμη καθοριστεί. Παρ’ ότι δεν υπάρχουν σθεναρές αποδείξεις που να προέρχονται από τυχαιοποιημένες ελεγχόμενες κλινικές μελέτες (RCTs), υπάρχουν ωστόσο σημαντικά στοιχεία προερχόμενα από μεγάλες μελέτες παρατήρησης που συνηγορούν υπέρ της χρήσης συνδυασμού αντιβιοτικών για τη θεραπεία λοιμώξεων από στελέχη K. pneumoniae ανθεκτικών στις καρβαπενέμες, κυρίως σε σοβαρά ασθενείς με υψηλό ρίσκο θανάτου. Η αγωγή με συνδυασμό αντιβιοτικών προτιμάται από τους περισσοτέρους ειδικούς και εφαρμόζεται με την ελπίδα της επίτευξης ευνοϊκότερου θεραπευτικού αποτελέσματος από αυτό που θα αναμενόταν από τη χρήση ενός μόνο αντιβιοτικού. Το αποτέλεσμα της δράσης συνδυασμού αντιβιοτικών μπορεί να είναι αθροιστικό, αδιάφορο ή και ανταγωνιστικό. Το ιδανικό είναι η συνεργική δράση, που σημαίνει ότι το τελικό αποτέλεσμα είναι ακόμη καλύτερο από το άθροισμα των δράσεων που έχει το καθένα απ’ αυτά. Στην εποχή των ελάχιστων, ή ακόμη και ανύπαρκτων στις περιπτώσεις των παν-ανθεκτικών παθογόνων, θεραπευτικών επιλογών έναντι πολυανθεκτικών μικροοργανισμών, οι συνεργικοί αντιμικροβιακοί συνδυασμοί είναι σημαντικό βοήθημα για το λοιμωξιολόγο. Με δεδομένη τη συχνότητα χρήσης της συνδυαστικής θεραπείας και των προσδοκιών που εναποτίθενται σε αυτήν, μια εργαστηριακή μέθοδος ικανή να προβλέψει τη συνέργεια μεταξύ αντιβιοτικών θα ήταν πολύτιμη. Παρ’ότι δεν υπάρχει μια «gold standard» μέθοδος για τη μελέτη της συνέργειας, αυτές που έχουν χρησιμοποιηθεί ευρύτερα στη βιβλιογραφία είναι η Καμπύλη Θανάτωσης στο Χρόνο (Time Kill Assay) και η Μέθοδος της Σκακιέρας (Checkerboard method), οι οποίες όμως εργώδεις, χρονοβόρες και ακατάλληλες για καθημερινή χρήση στο κλινικό μικροβιολογικό εργαστήριο. Θα ήταν χρήσιμο να βρεθεί μια μέθοδος το ίδιο αξιόπιστη, αλλά ταυτόχρονα και εφαρμόσιμη σε ένα κοινό μικροβιολογικό εργαστήριο. Στα πλαίσια αυτά, η παρούσα εργασία μελέτησε συνδυασμούς αντιβιοτικών που αποτελούν μερικές από τις τελευταίες θεραπευτικές επιλογές έναντι κλινικών στελεχών K.pneumoniae που παράγουν καρβαπενεμάσες διαφόρων τύπων, και συγκεκριμένα της τιγεκυκλίνης με είτε κολιστίνη, γενταμικίνη, φωσφομυκίνη ή μεροπενέμη, χρησιμοποιώντας τις μεθόδους της Καμπύλης Θανάτωσης στο Χρόνο, της Σκακιέρας και τρεις μεθόδους βασισμένες στη χρήση των Etest, προκειμένου να βρεθεί εάν κάποια από τις τελευταίες, που αποτελούν πολύ ευκολότερες και πρακτικά εφικτές διαδικασίες, μπορεί να αντικαταστήσει τις πρώτες. Προς τούτο, η Καμπύλη Θανάτωσης στο Χρόνο χρησιμοποιήθηκε ως μέθοδος αναφοράς, καθώς αρκετοί συγγραφείς θεωρούν πως παρέχει τις χρησιμότερες κλινικά πληροφορίες, αλλά και επειδή παραμένει η μοναδική πιστοποιημένη προς χρήση για το σκοπό αυτό εργαστηριακή μέθοδος. Με βάση τη μέθοδο αναφοράς, βρέθηκε συνέργεια στο 11% των συνδυασμών που μελετήθηκαν. Περισσότερο συνεργικός ήταν ο συνδυασμός της τιγεκυκλίνης με την κολιστίνη, σε ποσοστό 25%. Ακολούθησε ο συνδυασμός με γενταμικίνη σε ποσοστό 10%, με μεροπενέμη 8% και με φωσφομυκίνη 4.5%. Η μέθοδος της σκακιέρας έδωσε συνολικό ποσοστό συνέργειας 26.5% και οι μεθοδολογίες των Etest από 47% ως 2%. Το τελευταίο, και περισσότερο «αυστηρό» αποτέλεσμα έδωσε η μεθοδολογία Etest του «σταυρού». Τα αποτελέσματα αυτά βρίσκονται σε συμφωνία με αυτά που μπορεί να βρει κανείς ανατρέχοντας σε παρόμοιες δημοσιευμένες μελέτες συνδυασμών τιγεκυκλίνης έναντι στελεχών K.pneumoniae ανθεκτικής στις καρβαπενέμες, στις οποίες συχνό εύρημα αποτελεί η διαπίστωση συνέργειας μεταξύ τιγεκυκλίνης και κολιστίνης, ενώ υπάρχουν σποραδικά ευρήματα συνεργείας και με μεροπενέμη, γενταμικίνη ή φωσφομυκίνη. Μελετώντας το βαθμό συμφωνίας των υπολοίπων μεθόδων με τη μέθοδο αναφοράς ΚΘΧ, παρ’ ότι υπήρξαν σημαντικά ποσοστά παρατηρηθείσας συμφωνίας, από 50% ως 85%, αυτή φάνηκε να είναι στατιστικά πρακτικά ασήμαντη, με τη χρήση του συντελεστή ομοφωνίας Cohen’s kappa (κ). Με βάση αυτόν, ο οποίος συνυπολογίζει την πιθανότητα της συμφωνίας από τύχη, καθώς συνέργεια διαπιστωνόταν αραιά έως σπάνια, η συμφωνία όλων των υπολοίπων μεθόδων με τη μέθοδο αναφοράς ήταν πτωχή. Η μοναδική επί μέρους περίπτωση όπου βρέθηκε καλή στατιστική συμφωνία με τη μέθοδο αναφοράς ήταν η μέθοδος Etest σχηματισμού σταυρού για το συνδυασμό τιγεκυκλίνης/φωσφομυκίνης. Κάπως καλύτερη («κάποια») ήταν η στατιστική συμφωνία μεταξύ δύο από τις μεθοδολογίες Etest (MIC/MIC ratio και Άγαρ/Etest) με τη μέθοδο της σκακιέρας. Ανατρέχοντας και πάλι στη βιβλιογραφία, σε παρόμοιες μελέτες που ανακοίνωσαν βαθμό συμφωνίας μεθόδων όπως της παρούσας, αναφορικά με διάφορους gram-αρνητικούς μικροοργανισμούς, διαπιστώθηκε η μεγαλύτερη δυνατή ανομοιομορφία αποτελεσμάτων που ήταν δυνατό να βρεθεί, με αναφερόμενη συμφωνία από 0-100%. Εμβαθύνοντας στα αίτια της ασυμφωνίας των μεθόδων μας, καθώς και της εντυπωσιακής ποικιλότητας των βιβλιογραφικών δεδομένων, διαπιστώθηκε μια πλειάδα από πιθανούς αιτιολογικούς παράγοντες που σχετίζονται με τη φύση της κάθε μεθόδου και που καθιστούν δύσκολη τη σύγκριση των παραγομένων αποτελεσμάτων. Πρωτίστως, η ΚΘΧ μελετά το ρυθμό εξόντωσης ενώ οι υπόλοιπες την αναστολή ανάπτυξης ενός μικροοργανισμού, που αποτελούν διαφορετικά μεγέθη. Η πρώτη μελετά πώς δρουν συγκεκριμένες συγκεντρώσεις αντιβιοτικών, οι άλλες μετρούν Ελάχιστες Ανασταλτικές Συγκεντρώσεις (MIC). Τα παρόντα ευρήματα πιθανότατα αντανακλούν αυτές τις διαφορές μεταξύ ΚΘΧ και των υπολοίπων μεθόδων (και συνακολούθως των ομοιοτήτων σκακιέρας/Etest), καθώς δείχνουν ασυμφωνία μεταξύ της πρώτης και των τελευταίων, ενώ αντίθετα φανερώνουν κάποια συμφωνία μεταξύ των δύο από τις τρεις μεθοδολογίες Etest που δοκιμάστηκαν και της σκακιέρας. Σε σχέση με τις μεγάλες διαφορές μεθοδολογικής συμφωνίας που παρατηρούνται στη βιβλιογραφία πρέπει να ληφθεί ακόμη υπόψη πως οι παράμετροι που αξιολογεί ο κάθε ερευνητής μπορεί να ποικίλλουν, όπως για παράδειγμα η εκδήλωση συνέργειας σε ώρες άλλες από τις 24, καθώς και η εκδήλωση αθροιστικής, εκτός από συνεργική, δράσης. Άγνωστη επίσης είναι η επίδραση διαφορών στις δοκιμαζόμενες συγκεντρώσεις αντιβιοτικών, καθώς και στα μικροβιακά στελέχη που μπορεί να χρησιμοποιηθούν, καθώς μπορεί τούτα να είναι ευαίσθητα ή ανθεκτικά στα δοκιμαζόμενα αντιβιοτικά, και με άλλοτε άλλα ερμηνευτικά κριτήρια ευαισθησίας. Συμπεραίνει εύλογα κανείς ότι απαιτείται βελτιστοποίηση και προτυποποίηση των υπαρχόντων τεχνικών. Ωστόσο, και με την απουσία αληθούς «gold standard» για τη μελέτη της συνέργειας, είναι δύσκολο να αποφανθεί κανείς για την αξιοπιστία κάποιας από αυτές. Ο μόνος ασφαλής τρόπος για να γίνει αυτό είναι μέσω της συσχέτισης των αποτελεσμάτων τους με κλινικά στοιχεία, δηλαδή με την απόδειξη της κλινικής αποτελεσματικότητος ενός υποτιθέμενου, βάσει μιας ορισμένης μεθόδου, συνεργικού συνδυασμού. Τέτοιων αποδείξεων, με τη μορφή αποτελεσμάτων τυχαιοποιημένων ελεγχόμενων κλινικών μελετών, η βιβλιογραφία στερείται σχεδόν παντελώς. Η ανάγκη διεξαγωγής τέτοιων μελετών φαίνεται επιτακτική και στο χώρο της αναζήτησης συνέργειας αντιβιοτικών.