Isolation and characterization of breast cancer stem cells: the role of histone demethylase LSD1 in the biology of breast cancer stem cells

Abstract

Cancer stem cells (CSCs) constitute a cancer cell subpopulation with self-renewal and differentiation properties that are thought to sustain tumor growth and relapse after therapy. The ability of CSCs to survive after conventional anticancer treatment has spurred a major effort for the development of new therapeutic strategies that target these cells. Recent studies, suggest that, the unique properties of CSCs appear to be under epigenetic regulation. LSD1/KDM1A, a histone demethylase, is a stemness regulator while is also overexpressed in different human cancer types including breast cancer. In the present work, our aim was to investigate LSD1’s role in the chemoresistance of breast CSCs (bCSCs). Immunohistochemistry experiments in breast cancer tumor samples confirmed the association of LSD1 expression with less differentiated breast tumors. Moreover, manipulation of LSD1 expression with different experimental approaches associated the demethylase with the chemoresistance of breast cancer cells. In addition, we have established and characterize an in vitro mammosphere culture system enriched in bCSCs, knock-down and overexpression experiments showed that the enzyme could regulate the stemness properties of the CD44+/CD24-/low bCSC sub-population. Moreover, pharmacological inhibition of LSD1 led to a reduction of the bCSCs and impairment of its stemness potential in vitro, while it was able to restrain tumor growth, as well as, to decrease the bCSCs sub-population in vivo. Finally, chemotherapy resistance of bCSCs was confirmed in our system; however, pretreatment with an LSD1 inhibitor rendered the bCSCs more sensitive to these commonly used therapeutic modalities as shown by cell proliferation and mammosphere formation assays. Experiments with xenografts in mice are underway to confirm that LSD1 targeting in combination with chemotherapeutic agents is more efficient in inhibiting tumor growth. The above data strongly suggest that LSD1 is a druggable target in bCSCs as it was found to regulate their stemness properties and thus conferring to them chemoresistance abilities.

Τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΒΚ) αποτελούν έναν υποπληθυσμό των καρκινικών κυττάρων με ιδιότητες αυτο-ανανέωσης και διαφοροποίησης, που θεωρείται ότι ευθύνονται για την ανάπτυξη του όγκου και την υποτροπή μετά από θεραπεία. Η ικανότητα των ΚΒΚ να επιβιώνουν μετά από εφαρμογή συμβατικών μορφών αντικαρκινικής θεραπείας συνέβαλε στην προσπάθεια ανάπτυξης νέων θεραπευτικών στρατηγικών που στοχεύουν τα συγκεκριμένα κύτταρα. Πρόσφατες μελέτες, υποδεικνύουν ότι οι μοναδικές ιδιότητες των ΚΒΚ φαίνεται να υπόκεινται σε επιγενετική ρύθμιση. Η LSD1 / KDM1A, μία απομεθυλάση ιστονών, ρυθμίζει τις βλαστικές ιδιότητες των κυττάρων, ενώ επίσης υπερεκφράζεται σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου συμπεριλαμβανομένου και του καρκίνου του μαστού. Στην παρούσα εργασία, στόχος μας ήταν να διερευνήσουμε τον ρόλο της LSD1 στην χημειο-ανθεκτικότητα των ΚΒΚ του μαστού. Πειράματα ανοσοϊστοχημείας σε δείγματα ασθενών με καρκίνο του μαστού επιβεβαίωσαν τη σύνδεση της έκφρασης της LSD1 με λιγότερο διαφοροποιημένους όγκους του μαστού. Επιπλέον, ο γονιδιακός χειρισμός της έκφρασης της LSD1 με διαφορετικές πειραματικές προσεγγίσεις, συσχέτισε την απομεθυλάση με την χημειο-ανθεκτικότητα των καρκινικών κυττάρων του μαστού. Επιπροσθέτως, έχοντας εγκαθιδρύσει και χαρακτηρίσει εκτενώς ένα in vitro σύστημα καλλιέργειας σφαιρικών δομών εμπλουτισμένο σε καρκινικά βλαστικά κύτταρα του μαστού, πειράματα γονιδιακής αποσιώπησης και υπερέκφρασης, έδειξαν ότι το ένζυμο ρυθμίζει τις βλαστικές ιδιότητες του υπο-πληθυσμού των καρκινικών βλαστικών κυττάρων του μαστού CD44+/CD24-/low.. Επιπλέον, η φαρμακολογική αναστολή της LSD1 οδήγησε σε μείωση των ΚΒΚ και εξασθένιση του δυναμικού βλαστικότητας in vitro, ενώ ήταν σε θέση να οδηγήσει σε συρρίκνωση των όγκων και να μειώσει τον υποπληθυσμό ΚΒΚ in vivo. Εν κατακλείδι, η ανθεκτικότητα στη χημειοθεραπεία των καρκινικών βλαστικών κυττάρων του μαστού επιβεβαιώθηκε στο σύστημά μας μέσω των αντίστοιχων πειραματικών προσεγγίσεων. Ωστόσο, η χορήγηση ενός αναστολέα της LSD1 κατέστησε τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα του μαστού πιο ευαίσθητα στις ευρέως χρησιμοποιούμενες θεραπευτικές μεθόδους, όπως δείχνουν οι ποσοτικοί προσδιορισμοί του ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων και σχηματισμού σφαιρικών δομών. Πειράματα με ξενομοσχεύματα σε επίμυες βρίσκονται σε εξέλιξη για να επιβεβαιωθεί ότι η στόχευση της LSD1 σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες αναστέλλει αποτελεσματικότερα την ανάπτυξη όγκων. Τα παραπάνω δεδομένα υποδηλώνουν έντονα ότι η LSD1 αποτελεί έναν πιθανό θεραπευτικό στόχο στα καρκινικά βλαστικά κύτταρα του μαστού, καθώς βρέθηκε ότι ρυθμίζει τις βλαστικές ιδιότητες των κυττάρων αυτών και έτσι προσδίδει χημειο-ανθεκτικές ικανότητες.