Ανάπτυξη φορέων με ρυθμιστική ικανότητα στόχευσης διαφορετικών τύπων καρκίνων και μεθοδολογιών για τον εντοπισμό συνθηκών υπεύθυνων για την τροποποίηση κυστεϊνών σε σουλφενικό οξύ

Abstract

The current thesis consist of two chapters, which are connected as described below.Initially, we designed and synthesized a molecule that could act as multi-cargo drug delivery system and can be tuned against different type of cancer (Chapter 1.1). We actually developed a combined anticancer drug delivery system, that can be tuned for every different type of cancer and effectively attack specific sites. This chapter presents the therapeutic ability of this system against Glioblastoma Multiform (GBMs), an aggressive type of brain cancer. The resulting multi-cargo drug delivery system presented enhanced cell uptake as well as selective cytotoxicity in several glioblastoma cell lines without any side-effect in normal cells. Additionally, we conjugated a chromophore group, allowing the use of the resulting system as a theranostic agent. The use of the above drug delivery system as a theranostic agent, was the cause of the next study (Chapter 1.2), to develop a photo-stable chromophore group. For this reason we conjugated on Tat and GnRH peptide, two discrete chromophore groups that show strong luminescence in the visible region: (a) carboxy-fluorescein (5(6)-FAM) which exhibits green fluorescence and (b) a carboxy substituted ruthenium polypyridyl complex which exhibits red phosphorescence, and we compared their physicochemical properties on living cells. The photo-stable ruthenium complex showed enhanced photophysical properties on this study, suggesting that this two new peptide conjugates (Ru-Tat and Ru-GnRH) could be used for novel applications on targeting drug delivey.Additionally, is shown that protein S-sulphenylation is a transient post-translational multiple modification of cysteine side chain. Given the importance that this redox mediated transient S-sulphenylation of cysteine thiols can have as crucial regulatory mechanism of pathology, physiology and cell signaling, discovery of new S-sulphenylated sites in proteins is of paramount importance towards understanding how protein function is regulated upon redox conditions. We have developed the PRESS (PRotEin S- Sulphenylation server), which can effectively predict whether a cysteine thiol is prone to undergo S-sulfenylation (Chapter 2.1).The possibilities and the information that PRESS server offers, we contacted to the synthesis of four peptide models that bare a cysteine residue. Τhe peptide models were studied in detail by the use of NMR spectroscopy about how the microenvironment and various parameters can affect the cysteine oxidation to sulphenic acid (Chapter 2.2). NMR was a useful analytical tool on the current study, from which we came to conclusions about the effect of the charge of the side chain of the neighbor amino acids, the effect of the cysteines pKas and the solvent and temperature contribution during the cysteine thiol modification to sulphenic acid.

Η παρούσα διατριβή αποτελείται από δύο επιμέρους κεφάλαια τα οποία συνδέονται μεταξύ τους όπως συνοπτικά περιγράφεται παρακάτω. Αρχικά, σχεδιάσαμε και συνθέσαμε ένα μόριο που μπορεί να δρα ως πολυφορτιακό όχημα παράδοσης φαρμακευτικών ουσιών και δύναται να ρυθμιστεί ενάντια σε συγκεκριμένα καρκινικά κύτταρα (κεφάλαιο 1.1). Πρόκειται για την ανάπτυξη ενός αντικαρκινικού - συνδυαστικού συστήματος χορήγησης φαρμάκων, που μπορεί να ρυθμιστεί ενάντια σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου και να επιτίθεται αποτελεσματικά σε συγκεκριμένα κύτταρα. Το κεφάλαιο αυτό παρουσιάζει το θεραπευτικό δυναμικό αυτού του συστήματος έναντι των πολυμορφικών γλοιοβλαστωμάτων (GBMs), μια επιθετική μορφή καρκίνου του εγκεφάλου. Το προκύπτον πολυφορτιακό σύστημα χορήγησης φαρμάκων (τριμοριακό) παρουσιάζει ενισχυμένη κυτταρική πρόσληψη, καθώς και εκλεκτική κυτταροτοξικότητα σε κυτταρικές σειρές γλοιοβλαστώματος, χωρίς οποιαδήποτε παρενέργεια σε φυσιολογικά κύτταρα. Στην ίδια τριμοριακή ένωση ένας φθορίζων ανιχνευτής έχει επίσης ενσωματωθεί επιτρέποντας τη δυνατότητα χρησιμοποίησης του τριμοριακού φορέα ως θερανοστικό (theranostic) μέσο (θεραπεία και διάγνωση).Η χρήση του τριμοριακού φορέα ως θεραναστικό μέσο, έδωσε ώθηση για την επόμενη μελέτη (κεφάλαιο 1.2). Αποσκοπώντας στην αναπτυξη μίας φωτοσταθερής χρωμοφόρας ομάδας, πραγματοποιήσαμε σύζευξη του Tat και GnRH πεπτιδίου με δύο διακριτές χρωμοφόρες ομάδες που παρουσιάζουν ισχυρή φωταύγεια στο ορατό φάσμα: (α) την καρβοξυφλουορεσκεϊνη (5(6)-FAM) που αποδίδει πράσινο φθορισμό και (β) το πολυπυριδινικό σύμπλοκο του ρουθηνίου ([Ru(bipy)2(mcb)]2+) που αποδίδει κόκκινο φωσφορισμό, και συγκρίναμε τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες σε ζωντανά κύτταρα. Το φωτο-σταθερό χρωμοφόρο συμπλόκου του ρουθηνίου έδειξε προηγμένες φωτοφυσικές ιδιότητες σε αυτήν τη μελέτη, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα δύο νέα πεπτιδικά συζεύγματα (Ru-Tat και Ru-GnRH) μπορούν να χρησιμοποιηθούν για νέες στρατηγικές εφαρμογές στη στοχευμένη χορήγηση φαρμάκων.Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι η S-σουλφενυλίωση είναι μία κρίσιμη ενδιάμεση κατάσταση σε μια ποικιλία τροποποιήσεων της παράπλευρης ομάδας της κυστεΐνης. Δεδομένης της σημασίας που αυτή η οξειδοαναγωγική μεσολάβηση και παροδική S-σουλφενυλίωση της θειολικής κυστεΐνης υιοθετείται ως ρυθμιστικός μηχανισμός της παθολογίας, της φυσιολογίας και κυτταρικής σηματοδότησης, η ανακάλυψη νέων S-σουλφενυλιωμένων θέσεων σε πρωτεΐνες είναι μεγάλης σημασίας για την κατανόηση του μηχανισμού λειτουργίας της πρωτεΐνης υπό οξειδοαναγωγικές συνθήκες. Αναπτύξαμε τον διακομιστή PRESS (PROTEIN S-SULFENYLATION SERVER), o οποίoς μπορεί να προβλέψει αποτελεσματικά εκείνες τις κυστεϊνικές θειόλες μίας πρωτεΐνης που είναι επιρρεπείς σε S-σουλφενυλίωση (κεφάλαιο 2.1).Ορμώμενοι από τις δυνατότητες που προσφέρει ο διακομιστής PRESS, και τις πληροφορίες που παρέχει, προβήκαμε στην σύνθεση τεσσάρων πεπτιδικών μοντέλων που φέρουν κυστεΐνη. Τα πεπτιδικά μοντέλα μελετήθηκαν εκτενώς με χρήση φασματοσκοπίας ΝΜR ως προς το μικροπεριβάλλον και τις διάφορες παραμέτρους που μπορούν να επηρεάσουν την οξείδωση της κυστεΐνης προς σουλφενικό οξύ. Το NMR αποδείχθηκε ιδιαίτερα χρήσιμο αναλυτικό εργαλείο στην παρούσα μελέτη, από την οποία εξάγονται συμπεράσματα σχετικά με την επίδραση του φορτίου των γειτονικών αμινοξέων, την επίδραση του pKa των κυστεϊνών και τη συνεισφορά του διαλύτη και της θερμοκρασίας στη διαδικασία μετατροπής της κυστεϊνικής θειόλης σε σουλφενικό οξύ (κεφάλαιο 2.2).