Μέθοδοι συστημικής βιοπληροφορικής για την μελέτη των αλληλεπιδράσεων μικροβιώματος και βλεννογονίου ανοσολογικής απόκρισης ως στόχος νέων θεραπευτικών στρατηγικών

Abstract

Background. Mucosal immunology is a crucial part of the body’s defense against pathogens and the external environment. The mucosa operates selectively against harmful microorganisms and allows for the host’s symbiosis with commensal microbiota. The gastrointestinal tract contains the biggest mucosal surface in the human body and provides the perfect breeding ground for the microbiota due to its large and complex architecture. During homeostasis, the microbiota’s role is diverse and includes signaling and defense versus pathogens and inflammation (by interacting with the mucosa), vitamin production, digestive aid and metabolism of important nutrients. The genetic composition of all the microbes in a host is called the microbiome and has been implicated as a contributing factor and a deterrent in a variety of pathological conditions varying from neurological to cardiovascular and gastrointestinal. The compositional diversity of the gut microbiome is unique for each person and is influenced by geographic, lifestyle and environmental conditions. Perhaps the strongest associations between disease and microbial dysbiosis (the pathological imbalance of microbial communities) have been studied and observed in Inflammatory Bowel Diseases (IBD). IBD and their two main manifestations, Crohn’s Disease (CD) and Ulcerative Colitis (UC), are ideal for the study of the interactions between mucosal immunology and the microbiome due to their inflammatory background, their occurrence in the GI tract and their yet unknown etiology which involves both innate and adaptive immunity. CD, in particular, adds another complex pathophysiological layer with its fibrotic complications. Because of their complex background, the study of IBD requires multifaceted approaches for the elucidation of their molecular profile. Multi-omics approaches, which include genomics, epigenomics, transcriptomics, metabolomics proteomics and the study of the microbiome provide a unique perspective and in depth-knowledge on the pathophysiology and etiopathology of IBD (IBD-omics). Each of these methodologies relies on the production and analysis of a vast amount of biological information, far exceeding the human processing capabilities. Hence, the need for computational assistance arises and with it the scientific field of bioinformatics and especially systems bioinformatics which focuses on the interactions of these approaches. Aim and objectives. Aim of this thesis is to use system bioinformatics methods to search for and analyze interactions between the mucosal immune response and the gut microbiome using the involvement of the intestinal microflora in homeostatic and inflammatory activity as our main model. The focus is on exploring new molecular targets for therapeutic strategies in the treatment of IBD by searching through genetic, protein and metabolic features of the host and the gut microbiome alike. Materials and Methods. Depending on the molecular function under study a multitude of methodologies has been applied on patient samples and publicly available data. Phenotypes and sub-phenotypes of CD and UC were targeted in order to better classify these diseases and characterize individual molecular profiles. To study the genetic and proteomic background of IBD, SNPs associated with both CD and UC, and their sub-phenotypes (as those are characterized in the Montreal classification system), were obtained via a customized IBD risk GWAS panel performed on Greek patient samples. These SNPs were statistically associated with each phenotype via PLINK and then used as input for 2 distinct pipelines for pathway analysis via the KEGG database to detect functional interactions. The first one involved the bioinformatics tool PathwayConnector for the creation of complementary networks of interacting pathways, and the second via the STRING platform provided protein-protein association networks and the pathways those involve. Network analysis metrics, specifically network centralities, were utilized to identify proteins exhibiting significant IBD involvement and to subsequently rank the signaling pathways those proteins participate in. In addition, this has allowed for the construction of a network of pathological conditions which share parts of their molecular background with IBD. To study mucosa-microbial interactions a metagenomic in silico pipeline was implemented to study microbial diversity, taxonomic abundance, microbe-disease associations and microbial metabolism between the behavioral sub-phenotypes of CD (B1 non‐stricturing non‐penetrating, B2 stricturing and B3 penetrating). 16s rRNA sequencing data were obtained from two, publicly available via the QIITA microbial study management platform, CD patient versus healthy control datasets consisting of two, geographically distinct, populations. The bioinformatics tools and algorithms QIIME, Calypso, LEfSe, PICRUSt and STAMP were employed for the analyses. To study gene function during CD and the mechanisms behind fibrosis, expression data were obtained from publicly available microarray datasets via Gene Expression Omnibus. These datasets contained data from Crohn’s Disease, Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF), Systematic Scleroderma (SSc), Chronic Kidney Disease (CKD) and Liver Cirrhosis (LC) patients versus healthy controls. Each dataset was studied independently, to avoid bias due to different experimental conditions, using bioinformatics differential gene expression analysis via the GEO2R tool. Two separate groups were created containing combinations of dataset intersections calculated by the SuperExactTest R package. These groups contained the statistically significant (p < 0.05) differentially expressed genes versus healthy controls from the datasets of CD and the other fibrotic disorders. The intersection of these two groupings provided a gene signature for pathway analysis via the Reactome database. In addition, network analytics were applied to two tissue-specific, gene co-expression networks constructed by all the genes expressed on human terminal ileum and sigmoid to identify the molecular etiology behind topological preference of fibrosis during CD.Finally, to identify drugs and chemical compounds which can be used in IBD treatment regimens a computational drug repositioning pipeline was applied to the CD differential gene expression data obtained previously. The statistically significant genes (p < 0.05) of each dataset were split into two categories containing genes upregulated or downregulated versus healthy controls. The intersection of all CD datasets created a de novo CD gene signature. This signature was used as input for a) REACTOME to identify etiopathogenetic mechanisms of CD and b) CLUE.IO to identify compounds which reverse or amplify it. ResultsIn total 41 different loci were associated with IBD phenotypes versus Healthy Controls through our PLINK analysis. Four were found to be shared by CD and UC, three between B1 and B2 CD sub-phenotypes and none between the E1 and E3 UC sub-phenotypes. The complementary pathways and enriched protein-protein association networks revealed novel and well established molecular components of IBD, such as pathways involving apoptosis, Jak-STAT, PI3K-Akt, TNF, T-cell and B-cell receptor, MAPK and TLR signaling pathways. Also, 44 diseases were found to share molecular mechanisms with the IBD phenotypes and sub-phenotypes. The analyses established that IBD sub-phenotypes have distinct genetic and molecular profiles that can contribute to their accurate identification and classification. The analysis of the gut microbiome in association with the behavioral CD sub-phenotypes showed decreased biodiversity within all 3 Crohn’s disease sub-phenotypes versus healthy controls with the most pronounced reductions in B2 and B3 compared to B1. The complex B2 and B3 sub-phenotypes exhibited similar enterotypes to each other and different from those of B1 and healthy controls. The same pattern was highlighted by the differential abundance, correlation coefficient and microbial metabolic analyses where B1 was behaving differently than B2 and B3. Finally, several microbial taxa were highlighted as potential biomarkers for the classification of all sub-phenotypes and disease progression. These findings establish that there are distinct differences in complicated Crohn’s disease sub-phenotypes versus B1 and healthy controls. The study into the molecular background of fibrosis revealed 7 common DE genes among all CD datasets (CXCL1, ICAM1, PHLPP2, ZKSCAN1, ATP9A, NCF4, CACNA2D1). The intersection of all fibrotic disease differentially expressed genes versus healthy controls, showed 241 common genes contributing to 12 pathways associated with fibrosis and 17 with inflammation/immune response. Tissue-specific co-expression networks revealed 122/241 genes expressed on the terminal ileum and only 32/241 on the sigmoid. Regarding signaling pathways, 9 fibrosis- and 6 inflammation-related ones were featured on terminal ileum and only 1 fibrosis- and 5 inflammation-related on the sigmoid. Finally, trying to find drugs and chemical compounds which are beneficial or harmful for CD several thousand differentially expressed genes versus healthy controls were identified. Their intersection highlighted 39 upregulated and 12 downregulated genes for a de novo gene signature. These, respectively, were implicated in 26 and 52 inflammatory and immunological signaling pathways. In total, 22 compounds were found to reverse the gene signature and could be examined for drug repositioning, whereas. 33 amplify it and might be involved in CD exacerbation. Interestingly, no significant correlation was found between the common clinical practice drugs and the IBD gene signature, indicating no interactions. Conclusions. This work establishes distinct differential molecular and microbial backgrounds of IBD phenotypes and sub-phenotypes through the utilization of systems bioinformatics approaches and traditional bioinformatics tools. It showcases how their genetic variation, gene expression, metabolomic and microbiome differences can be interpreted and associated with innate and acquired immunity mechanisms via the mucosa allowing for specific classification and unique identification of molecular and microbial therapeutic targets. Finally, this thesis sets the ground for combinational approaches in future works.

Εισαγωγικά. Η ανοσολογία του βλεννογόνου είναι ένα κρίσιμο μέρος της άμυνας μας έναντι παθογόνων οργανισμών και του εξωτερικού περιβάλλοντος. Ο βλεννογόνος λειτουργεί επιλεκτικά έναντι των βλαβερών μικροοργανισμών και επιτρέπει την ειρηνική συμβίωση του ξενιστή με την μικροχλωρίδα. Ο γαστρεντερικός σωλήνας φιλοξενεί τη μεγαλύτερη βλεννογονική επιφάνεια στο ανθρώπινο σώμα και παρέχει το τέλειο έδαφος αναπαραγωγής για την μικροχλωρίδα λόγω του μεγάλου μεγέθους και της σύνθετης αρχιτεκτονικής του. Κατά τη διάρκεια της ομοιόστασης, ο ρόλος της μικροχλωρίδας ποικίλει περιλαμβάνοντας τη σηματοδότηση και την άμυνα έναντι παθογόνων οργανισμών και της φλεγμονής (αλληλεπιδρώντας με τον βλεννογόνο), την παραγωγή βιταμινών, την επικουρική πεπτική λειτουργία και τον μεταβολισμό σημαντικών θρεπτικών ουσιών. Η γενετική σύνθεση όλων των μικροβίων σε έναν περιβάλλον ονομάζεται μικροβίωμα και έχει εμπλακεί ως θετικός και αρνητικός παράγοντας σε μια ποικιλία παθολογικών καταστάσεων, από νευρολογικές έως καρδιαγγειακές και γαστρεντερικές. Η σύσταση και ποικιλομορφία της μικροχλωρίδας του εντέρου είναι μοναδική για κάθε άτομο και επηρεάζεται από τον τόπο διαμονής, τον τρόπο ζωής και τις περιβαλλοντικές συνθήκες. Ίσως οι ισχυρότερες συσχετίσεις μεταξύ ασθένειας και μικροβιακής δυσβίωσης (παθολογικής ανισορροπίας των μικροβιακών κοινοτήτων) έχουν μελετηθεί και παρατηρηθεί στις Ιδιοπαθείς Φλεγμονώδεις Νόσους του Εντέρου (ΙΦΝΕ). Οι ΙΦΝΕ και οι δύο κύριες εκδηλώσεις τους, η Νόσος του Crohn (NC) και η Ελκώδης Κολίτιδα (ΕΚ), είναι ιδανικές για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ του βλεννογόνου και του μικροβιώματος λόγω του φλεγμονώδους υποβάθρου τους, της εμφάνισής τους στον γαστρεντερικό σωλήνα και της άγνωστης αιτιολογίας τους που περιλαμβάνει τόσο την φυσική όσο και την επίκτητη ανοσία. Η NC, ειδικότερα, προσθέτει ακόμα μία σύνθετη παθοφυσιολογική παράμετρο με τις ινωτικές επιπλοκές της.Λόγω του σύνθετου υποβάθρου τους, η μελέτη των ΙΦΝΕ απαιτεί πολύπλευρες προσεγγίσεις για τη διευκρίνιση του μοριακού τους προφίλ. Οι προσεγγίσεις πολλαπλών -omics, οι οποίες περιλαμβάνουν τη γονιδιωματική, την επιγονιδιωματική, την μεταγραφομική, την πρωτεωμική, την μεταβολομική και την μελέτη του μικροβιώματος, παρέχουν μια μοναδική ευκαιρία για την μελέτη εις βάθος της παθοφυσιολογίας και της αιτιολογίας των ΙΦΝΕ (IBD-omics). Κάθε μία από αυτές τις μεθοδολογίες βασίζεται στην παραγωγή και ανάλυση ενός μεγάλου όγκου βιολογικών δεδομένων, υπερβαίνοντας κατά πολύ τις δυνατότητες επεξεργασίας τους από τον άνθρωπο. Ως εκ τούτου, ανακύπτει η ανάγκη για υπολογιστική βοήθεια και μαζί της το επιστημονικό πεδίο της βιοπληροφορικής και ιδιαίτερα της συστημικής βιοπληροφορικής που επικεντρώνεται στις αλληλεπιδράσεις αυτών των προσεγγίσεων. Σκοπός. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η χρήση μεθόδων συστημικής βιοπληροφορικής για την αναζήτηση και ανάλυση αλληλεπιδράσεων μεταξύ της βλεννογονίου ανοσολογικής απόκρισης και του μικροβιώματος χρησιμοποιώντας σαν κύριο μοντέλο την εμπλοκή της μικροχλωρίδας του εντέρου στην ομοιόσταση και φλεγμονώδη εξεργασία του εντερικού βλεννογόνου. Η μελέτη αυτή θα γίνει στοχεύοντας στην αναζήτηση νέων θεραπευτικών στρατηγικών και μοριακών στόχων στην αντιμετώπιση της εντερικής φλεγμονής. Υλικά και μέθοδοι. Ανάλογως την μοριακή λειτουργία υπό μελέτη, στα πλαίσια αυτής της διατριβής, έχουν εφαρμοστεί οι κατάλληλες μεθοδολογίες σε δείγματα ασθενών και δεδομένα διαθέσιμα στο κοινό. Οι φαινότυποι και οι υπο-φαινοτύποι της NC και της ΕΚ αποτέλεσαν τους κύριους στόχους προς μελέτη, προκειμένου να ταξινομηθούν καλύτερα αυτές οι παθήσεις και να χαρακτηριστούν τα μοναδικά μοριακά τους προφίλ. Προκειμένου να μελετηθεί το γενετικό και πρωτεϊνικό υπόβαθρο των ΙΦΝΕ, σημειακοί πολυμορφισμοί (SNPs), που σχετίζονται με την NC και την ΕΚ και τους υπο-φαινότυπους τους (όπως αυτοί χαρακτηρίζονται στο σύστημα ταξινόμησης κατά Μόντρεαλ), ανιχνεύθηκαν μέσω μιας προσαρμοσμένης μικροσυστοιχίας δεδομένων GWAS κινδύνου των ΙΦΝΕ πάνω σε δείγματα Ελλήνων ασθενών . Αυτά τα SNPs σχετίστηκαν στατιστικά με κάθε φαινότυπο μέσω του υπολογιστικού εργαλείου PLINK. Στην συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν ως είσοδος για 2 διαφορετικές μεθόδους ανάλυσης μοριακών μονοπατιών, βασισμένες σε δεδομένα της βάσης KEGG, για την ανίχνευση λειτουργικών αλληλεπιδράσεων. Η πρώτη μέθοδος μέσω του εργαλείου βιοπληροφορικής PathwayConnector δημιουργεί συμπληρωματικά δίκτυα μοριακών μονοπατιών με σκοπό την επίτευξη ενός πλήρως συνδεδεμένου δικτύου. Η δεύτερη, μέσω της πλατφόρμας STRING παρήγαγε δίκτυα συσχετίσεως πρωτεϊνών και ενέπλεξε συγκεκριμένα μοριακά μονοπάτια. Για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών που εμφανίζουν σημαντική συμμετοχή στις ΙΦΝΕ και την μετέπειτα βαθμολογική ταξινόμηση των μοριακών μονοπατιών στα οποία αυτές συμμετέχουν, πραγματοποιήθηκαν τοπολογικές μετρήσεις δικτύου, και συγκεκριμένα centrality analyses. Επιπλέον, οι αναλύσεις αυτές επέτρεψαν την κατασκευή ενός δικτύου παθολογικών καταστάσεων οι οποίες μοιράζονται μοριακούς μηχανισμούς με τις ΙΦΝΕ. Για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ βλεννογόνου και μικροβίων εφαρμόστηκε μία υπολογιστική μεθοδολογία ανάλυσης μικροβιώματος. Αναλύθηκαν η μικροβιακή ποικιλότητα, η ταξινομική αφθονία, οι συσχετίσεις μικροβίων-πάθησης καθώς και ο μικροβιακός μεταβολισμός, ανάμεσα στους υπο-φαινοτύπους συμπεριφοράς της NC (Β1 μη στενωτική – μη διατιτραίνουσα, Β2 στενωτική, Β3 διατιτραίνουσα). Για τις αναλύσεις αυτές, εξετάστηκαν αλληλουχίες 16s rRNA από δύο σύνολα δεδομένων ασθενών με ΝC και υγιών μαρτύρων (διαθέσιμα στο κοινό μέσω της πλατφόρμας μικροβιακής μελέτης QIITA), από δύο γεωγραφικά διακεκριμένους πληθυσμούς. Οι αναλύσεις έγιναν με τις εφαρμογές και πλατφόρμες βιοπληροφορικής QIIME, Calypso, LEfSe, PICRUSt και STAMP.Για να μελετήσουμε τη λειτουργία των γονιδίων κατά τη ΝC και τους μηχανισμούς πίσω από την ίνωση, ελήφθησαν δεδομένα γονιδιακής έκφρασης από σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχιών, διαθέσιμα στο κοινό μέσω του Gene Expression Omnibus. Αυτά τα σύνολα περιείχαν δεδομένα από ασθενείς με NC, Ιδιοπαθή Πνευμονική Ίνωση (IPF), Συστηματικό Σκληρόδερμα (SSc), χρόνια νεφρική νόσο (CKD) και Κίρρωση Ήπατος (LC) καθώς και φυσιολογικούς μάρτυρες. Κάθε ομάδα δεδομένων μελετήθηκε ανεξάρτητα, για να αποφευχθεί η μεροληψία λόγω διαφορετικών πειραματικών συνθηκών, χρησιμοποιώντας βιοπληροφορική ανάλυση διαφορικής γονιδιακής έκφρασης μέσω του εργαλείου GEO2R. Αυτές οι ομάδες περιείχαν τα στατιστικά σημαντικά (ρ <0,05) διαφορικά εκφρασμένα γονίδια έναντι υγιών μαρτύρων από τα σύνολα δεδομένων NC και τις υπόλοιπες ινωτικές διαταραχές, αντίστοιχα . Η τομή αυτών των δύο ομάδων ανέδειξε μια «ινωτική γονιδιακή υπογραφή» 241 γονιδίων που. Η υπογραφή αυτή βοήθησε στην ανάλυση μοριακών μονοπατιών μέσω της βάσης δεδομένων Reactome. Επιπλέον, αναλύσεις δικτύου έγιναν σε δύο ιστοειδικά δίκτυα γονιδιακής συν-έκφρασης που σχηματίστηκαν, από όλα τα γονίδια που συν-εκφράστηκαν στον ανθρώπινο τελικό ειλεό και το σιγμοειδές, για να αναγνωρίσουν τη μοριακή αιτιολογία πίσω από την τοπολογική προτίμηση της ίνωσης κατά τη διάρκεια της NC .Τέλος, για τον εντοπισμό φαρμάκων και χημικών ενώσεων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε θεραπευτικά σχήματα των ΙΦΝΕ, χρησιμοποιήθηκε υπολογιστική επανατοποθέτηση φαρμάκου στα δεδομένα διαφορικής γονιδιακής έκφρασης NC που ελήφθησαν προηγουμένως. Τα στατιστικά σημαντικά γονίδια (p <0,05) κάθε ομάδας δεδομένων χωρίστηκαν σε δύο κατηγορίες που περιείχαν γονίδια υπερεκφραζόμενα ή υποεκφραζόμενα έναντι υγιών μαρτύρων. Η τομή όλων των συνόλων δεδομένων NC ανέδειξε μια de novo «υπογραφή γονιδιακής έκφρασης» της NC. Αυτή η υπογραφή χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση των αιτιοπαθογενετικών μηχανισμών της ΝC μέσω της REACTOME καθώς και για την ταυτοποίηση χημικών ενώσεων που την αντιστρέφουν ή την ενισχύουν μέσω του CLUE.IO. Αποτελέσματα. Συνολικά, συχετίστηκαν 41 σημειακοί πολυμορφισμοι με τους φαινοτύπους των ΙΦΝΕ, έναντι των υγιών μαρτύρων, μέσω της ανάλυσης PLINK. Τέσσερις βρέθηκαν κοινοί μεταξύ NC και EK, τρεις μεταξύ των υπο-φαινοτύπων Β1 και Β2 της NC και κανένας μεταξύ των υπο-φαινοτύπων Ε1 και Ε3 της ΕΚ. Τα συμπληρωματικά μοριακά μονοπάτια και τα εμπλουτισμένα δίκτυα συσχέτισης πρωτεϊνών αποκάλυψαν νέα αλλά και γνωστά μόρια και μηχανισμούς κινδύνου των ΙΦΝΕ. Μηχανισμοί σχετιζόμενοι με την απόπτωση, τον υποδοχέα της Jak-STAT, την PI3K-Akt, τον TNF, τα Τ- και Β- λεμφοκύτταρα, την MAPK και τον TLR συσχετίστηκαν ισχυρά. Επίσης, βρέθηκαν 44 παθήσεις μοριακούς μηχανισμούς κοινούς με τους φαινοτύπους και τους υπο-φαινότυπους των ΙΦΝΕ. Οι αναλύσεις έδειξαν ότι οι υπο- φαινότυποι των ΙΦΝΕ έχουν ξεχωριστά γενετικά και μοριακά προφίλ που μπορούν να συμβάλουν στην ακριβή τους ταυτοποίηση και ταξινόμηση. Η ανάλυση του εντερικού μικροβιώματος σε συνδυασμό με τoυς υπο-φαινοτύπους συμπεριφοράς της ΝC έδειξε μειωμένη βιοποικιλότητα εντός όλων των 3 υπο-φαινοτύπων έναντι υγιών μαρτύρων, με τις πιο έντονες μειώσεις στους Β2 και Β3 σε σύγκριση με τον Β1. Οι περιπεπλεγμένοι υπο-φαινότυποι Β2 και Β3 εμφάνισαν παρόμοιους εντερότυπους μεταξυ τους και διαφορετικούς από αυτούς του Β1 και των φυσιολογικών μαρτύρων. Το ίδιο μοτίβο επισημάνθηκε από τη διαφορική μικροβιακή αφθονία μεταξύ των υπο-φαινοτύπων, την ανάλυση συσχέτισης φαινοτύπου-μικροβιακών ομάδων και τις μικροβιακές μεταβολικές διεργασίες όπου ο Β1 συμπεριφερόταν διαφορετικά από τους Β2 και Β3. Τέλος, πλήθος μικροβίων αναδείχτηκαν ως δυνητικοί βιοδείκτες για την ταξινόμηση όλων των υπο-φαινοτύπων και της προόδου της NC. Αυτά τα ευρήματα αποδεικνύουν ότι υπάρχουν διακριτές διαφορές ανάμεσα στην στενωτική και διαιτιτραίνουσα μορφή της NC έναντι της φλεγμονώδους και των φυσιολογικών μαρτύρων. Η μελέτη σχετικά με το μοριακό υπόβαθρο της ίνωσης αποκάλυψε 7 διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια έναντι υγιών μαρτύρων ανάμεσα σε όλα τα σύνολα δεδομένων ΝC (CXCL1, ICAM1, PHLPP2, ZKSCAN1, ATP9A, NCF4, CACNA2D1). Η τομή όλων των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε όλες τις παθήσεις που χαρακτηρίζονται από ίνωση, ανέδειξε 241 κοινά γονίδια που συμμετέχουν σε 12 μονοπάτια που σχετίζονται με ίνωση και 17 σχετιζόμενα με φλεγμονή / ανοσοαπόκριση. Τα ιστοειδικά δίκτυα συνεκφράσεως αποκάλυψαν 122/241 γονίδια που συνεκφράζονται στον τελικό ειλεό και μόνο 32/241 στο σιγμοειδές. Όσον αφορά τα μοριακά μονοπάτια στους ιστούς αυτούς, 9 ινωτικά και 6 φλεγμονώδη εμφανίστηκαν στον τελικό ειλεό και μόνο 1 ινωτικό και 5 φλεγμονώδη στο σιγμοειδές.Τέλος, εντοπίστηκαν φάρμακα και χημικές ενώσεις που έχουν πιθανό θεραπευτικό ή επιβλαβή χαρακτήρα στην NC μέσα από διαφορικά εκφραζόμενα γονιδία έναντι φυσιολογικών μαρτύρων. Η τομή των γονιδίων σε όλα μας τα σύνολα δεδομένων υπογράμμισε 39 υπερεκφραζόμενα και 12 υποεκφραζόμενα γονίδια. Αυτά εμπλέκονται σε 26 και 52, αντιστοίχως, φλεγμονώδεις και ανοσολογικόυς μοριακούς μηχανισμούς. Συνολικά, βρέθηκαν 22 χημικές ενώσεις που αντιστρέφουν την έκφραση αυτών των γονιδίων και θα μπορούσαν να εξεταστούν για επανατοποθέτηση φαρμάκων, ενώ, 33 που την ενισχύουν και μπορεί να εμπλέκονται στην επιδείνωση της NC. Έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον ότι καμία σημαντική συσχέτιση δεν βρέθηκε μεταξύ των φαρμάκων της καθημερινής κλινικής πράξης και των γονιδίων αυτών, υποδηλώνοντας έλλειψη αλληλεπιδράσεων. Συμπεράσματα. Η διατριβή αυτή χαρακτηρίζει το ξεχωριστό μοριακό και μικροβιακό υπόβαθρο των φαινοτύπων και υπο-φαινóτυπων των ΙΦΝΕ μέσω μεθόδων συστημικής βιοπληροφορικής και παραδοσιακών εφαρμογών βιοπληροφορικής. Παρουσιάζονται οι τρόποι με τους οποίους η γενετική διαφοροποίηση, η γονιδιακή έκφραση και οι μεταβολικές και μικροβιακές διαφορές μπορούν να ερμηνευθούν και να συσχετιστούν με φυσικούς και επίκτητους μηχανισμούς ανοσίας μέσω του βλεννογόνου επιτρέποντας την αναγνώριση μοναδικών μοριακών και μικροβιακών θεραπευτικών στόχων. Τέλος, επιδεικνύεται η ανάγκη για περισσότερες συνδυαστικές προσεγγίσεις σε μελλοντικές μελέτες.