Αξιολόγηση δραστικότητας νανοσωματιδίων έναντι πολυανθεκτικών βακτηρίων

Abstract

The increasing frequency of multidrug resistant bacterial infections in nosocomial settings is widely recognized as one of the most urgent public health problems. The main directions to compact the dire consequences of the multidrug resistance threat are: a) the multifaceted containment of the spreading of multidrug resistant (MDR) strains and b) the development of new therapeutic approaches. Among the latter, the use of cyclodextrin based nanocarriers has been proposed for the targeted carrying of antibiotic substances at the site of infection (improving their pharmacokinetic properties) as well as for their protection from antimicrobial resistance mechanisms. Furthermore, modified and antibiotic free nanoparticles could be used either as direct antimicrobial agents or as indirect inhibitors of important resistance mechanisms. In this study, we examined natural and modified nanoparticles and cyclodextrins for their properties either as carriers of clinically available antimicrobial agents, as direct antimicrobial compounds or as indirect ones, exerting inhibitory properties against the main antimicrobial resistance mechanisms. The positively charged octacis (6-(2-aminomethyl)-6-deoxy)-γ-cyclodextrin (γ-Cys), produced by N.C.S.R. Demokritos, in preliminary studies was shown to produce strong complexes with the penicillin oxacillin, protecting it from the carbapenamase Oxa-1, reducing the hydrolysis rate in photometric studies. In-vitro, the γ-Cys cyclodextrin presented a desirable toxicological profile, as it did not exhibit signs of cytotoxicity even in high concentrations. Lastly, we determined its ability to enter in macrophages, carrying its antimicrobial load and significantly increasing its intracellular concentration. We also examined modified cyclodextrins for their applications as inhibitors against resistant mechanisms such as efflux pumps and MBLs. The AMBnTßCD cyclodextrins, produced by Innovative Biologics (U.S.A.), are modified with 7 positive charged subunits (7+ß-CD) and were studied as inhibitors for the RND efflux systems, produced by clinical strains of Α. baumannii. In in-vitro studies, they successfully re-sensitized clinical strains producing such efflux systems in the antibiotics tetracycline and ciprofloxacin. Their re-sensitizing properties were proven both in MIC determination studies and in time-kill assays. In these assays the bacterial load was reduced by at least 1,5 log10 in the presence of nanomolar concentrations of the AMBnTßCD compared to the free antibiotic, at the end of a 24 hour incubation. The modified cyclodextrins, produced by N.C.S.R. Demokritos, exhibited significant synergy with newer b-lactams in in-vitro, ex-vivo and in-vivo studies, against MDR Gram-negative clinical strains.

Η υψηλή συχνότητα λοιμώξεων από πολυανθεκτικά στελέχη διαφόρων παθογόνων μικρο-οργανισμών, κυρίως σε νοσοκομειακούς ασθενείς, έχει διεθνώς αναγνωριστεί ως ένα από τα σοβαρότερα προβλήματα δημόσιας υγείας. Οι κύριες κατευθύνσεις για την αντιμετώπιση του προβλήματος είναι α) ο πολυεπίπεδος περιορισμός της διασποράς των ανθεκτικών στελεχών και β) η ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Μεταξύ των τελευταίων έχει προταθεί και η χρήση νανοφορέων βασισμένων σε κυκλοδεξτρίνες για τη στοχευμένη μεταφορά των αντιβιοτικών στις εστίες λοίμωξης (βελτίωση φαρμακοκινητικών ιδιοτήτων) καθώς και την προστασία τους από τους μηχανισμούς αντοχής. Επιπλέον, ειδικά διαμορφωμένα και ελεύθερα αντιβιοτικών νανοσωματίδια θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν είτε ως άμεσοι αντιμικροβιακοί παράγοντες είτε έμμεσα ως καταστολείς σημαντικών μηχανισμών αντοχής. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν φυσικά και τεχνητά νανοσωματιδία και κυκλοδεξτρίνες είτε ως φορείς των κλινικά διαθέσιμων αντιμικροβιακών ουσιών είτε ως άμεσοι αντιμικροβιακοί παράγοντες, είτε ως έμμεσοι καταστέλλοντας σημαντικούς και κύριους μηχανισμούς αντοχής. Η θετικά φορτισμένη οκτάκις (6-(2-αμινομθυλίο)-6-δεόξυ)-γ-κυκλοδεξτρίνη (γ-Cys), παραγωγής του Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. Δημόκριτος (Ελλάδα), εμφανίστηκε να σχηματίζει ισχυρά σύμπλοκα με την πενικιλλίνη οξακιλλίνη, προστατεύοντας την μερικώς από την από την καρβαπενεμάση Οxa-1, μειώνοντας την ταχύτητα υδρόλυσής της σε πειράματα φωτομετρίας. Ιn-vitro, εμφάνισε ένα επιθυμητό τοξικολογικό προφίλ, καθώς δεν παρουσιάστηκαν σημάδια κυτταροτοξικότητας ακόμα και σε υψηλές συγκεντρώσεις. Τέλος, εξακριβώθηκε η ιδιότητά της να εισέρχεται σε μακροφάγα κύτταρα, μεταφέροντας και αυξάνοντας την ενδοκυττάρια συγκέντρωση του αντιβιοτικού της φορτίου, λειτουργώντας ως νανομεταφορέας του αντιβιοτικού. Eξετάστηκαν επίσης τεχνητές κυκλοδεξτρίνες για την δράση τους ως μόρια αναστολείς κατά διαδεδομένων μηχανισμών αντιμικροβιακής αντοχής όπως οι αντλίες εκροής και οι ΜΒΛ. Οι κυκλοδεξτρίνες AMBnTßCD, παραγωγής της Ιnnovative Biologics (Η.Π.Α.), που περιέχουν 7 θετικά φορτισμένες ομάδες (7+ßCD) μελετήθηκαν ως ανασταλτικοί παράγοντες συστημάτων αντλιών εκροής RND επταπλής συμμετρίας, κλινικών στελεχών Α. baumannii. Σε νανομοριακές συγκεντρώσεις, επανευαισθητοποίησαν, in-vitro, κλινικά στελέχη που εκφράζουν αντλίες RND στην τετρακυκλίνη και σιπροφλοξακίνη. Η δραστικότητα τους αποδείχθηκε τόσο σε πειράματα προσδιορισμού ΜΙC όσο και σε πειράματα προσδιορισμού καμπυλών θανάτωσης όπου το βακτηριακό φορτίο παρουσία της AMBnTßCD μειώθηκε τουλάχιστον 1,5 log10 σε σύγκριση με εκείνο του ελεύθερου αντιβιοτικού μετά από 24 ώρες επώαση. Άλλες κυκλοδεξτρίνες με ποικιλία υποκαταστατών, παραγωγής του Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. Δημόκριτος (Ελλάδα), έδειξαν συνεργική δράση με νεώτερα β-λακταμικά αντιβιοτικά σε πειράματα in-vitro, ex-vivo και in-vivo, κατά πολυανθεκτικών Gram-αρνητικών κλινικών στελεχών.