Χαρακτηρισμός κλινικών στελεχών Gram-αρνητικών βακτηρίων με αντοχή στα β-λακταμικά αντιβιοτικά

Abstract

We describe the discovery in K pneumoniae of MIR-1, a novel plasmid-mediated β-lactamase that has many of the properties of a class I enzyme. Klebsiella pneumoniae isolates from 11 patients at the Miriam Hospital, (Rhode Island, USA) were identified as resistant to cefoxitin and ceftibuten as well as to aztreonam, cefotaxime, and ceftazidime. Resistance could be transferred by conjugation or transformation with plasmid DNA into Eschenichia coli and was due to the production of a β-lactamase with an isoelectric point of 8.4 named MIR-1. In E. coli, MIR-1 conferred resistance to aztreonam,cefotaxime, ceftazidime, ceftibuten, ceftriaxone, and such a-methoxy beta lactams as cefmetazole, cefotetan,cefoxitin, and moxalactam. In vitro, MIR-1 hydrolyzed cephalothin and cephaloridine much more rapidly than it did penicillin G, ampicillin, or carbenicillin. Cefotaxime was hydrolyzed at 10% the rate of cephaloridine. Cefoxitin inactivation could only be detected by a microbiological test. The inhibition profile of MIR-1 was similar to that of chromosomally mediated class I, β-lactamases. Potassium clavulanate had little effect on cefoxitin or ceftibuten resistance and was a poor inhibitor of MIR-1 activity. Cefoxitin or imipenem did not induce MIR-1. The gene determining MIR-1 was cloned on a 1.4-kb AccI-PstI fragment. Under stringent conditions, probes for TEM-1 and SHV-1 genes and the E. coli ampC gene failed to hybridize with the MIR-1 gene. However, a provisional sequence of 150 bp of the MIR-1 gene proved to be 90% identical to the sequence of ampC from Enterobacter cloacae but only 71% identical to that of E. coli, thus explaining the lack of hybridization to the E. coli ampC probe. Plasmid profiles of the 11 K. pneumoniae clinical isolates were not identical, but each contained a plasmid from 40 to 60 kb that hybridized with the cloned MIR-1 gene. Both transfer-proficient and transfer-deficient MIR-1 plasmids belonged to the N incompatibility group. Thus, the resistance of these K. pneumoniae strains was the result of plasmid acquisition of a class I β-lactamase, a new resistance determinant that expands the kinds of beta-lactam resistance capable of spread by plasmid dissemination among clinical isolates.

Περιγράφουμε τις ιδιότητες και τη γενετική προέλευση της πρώτης πλασμιδιακής β-λακταμάσης τύπου ΑmpC. Η μελέτη μας έδειξε τη δυνατότητα των γονιδίων ampC να μεταφερθούν σε πλασμίδια και να εξαπλωθούν σε κλινικά στελέχη. Μελετήσαμε ενδονοσοκομειακά στελέχη Κ.pneumoniae από 11 ασθενείς του νοσοκομείου Miriam, RI, ΗΠΑ. Τα στελέχη ήταν ανθεκτικά στην αζτρεονάμη, κεφοταξίμη, κεφταζιδίμη, κεφτριαξόνη και α-μεθοξυ β-λακτάμες όπως η κεφμεταζόλη, η κεφοτετάνη, η κεφοξιτίνη και η μοξαλακτάμη. Η αντοχή οφειλόταν σε μια πλασμιδιακή β-λακταμάση που ονομάσαμε MIR-1. Υπό αυστηρές συνθήκες υβριδισμού, ανιχνευτές για τη TEM-1, SHV-1 και AmpC από E.coli δεν υβριδοποιηθήκαν με το γονίδιο MIR-1. Μια μερική αλληλουχία 150 βάσεων του γονιδίου αποδείχτηκε κατά 90% ταυτόσημη με την αλληλουχία της AmpC από το E.cloacae αλλά μονό κατά 71% ταυτόσημη με την AmpC του E.coli εξηγώντας τα αρνητικά αποτελέσματα υβριδισμού. In vitro η β-λακταμάση MIR-1 υδρολύει την κεφαλοθίνη και την κεφαλοριδίνη πιο αποτελεσματικά από την πενικιλίνη, την αμπικιλλίνη και την καρβενικιλλίνη. Το ποσοστό υδρόλυσης της κεφοταξίμης σχετικά με τη κεφαλοριδίνη είναι 10%. Αδρανοποίηση της κεφοξιτίνης πιστοποιήθηκε μονό με μια βιολογική μέθοδο. Οι συγκεντρώσεις αναστολέων των β-λακταμασών που απαιτούνται για την αναστολή της δραστικότητας της ΜΙR-1 είναι 50% και ήταν παρόμοιες με τις συγκεντρώσεις που απαιτούνται για τις χρωμοσωμικές β-λακταμάσες. Η προσθήκη κλαβουλανικού οξέος δεν αποκαθιστά την ευαισθησία στην κεφοξιτίνη. Η ΜΙR-1 δεν είναι επαγώγιμη παρουσία κεφοξιτίνης ή ιμιπενέμης. Ανάλυση του πλασμιδιακού DNA από τα κλινικά στελέχη K.pneumoniae έδειξε τη παρουσία διαφορετικών πλασμιδίων μεγέθους 40-60 Κb τα οποία υβριδοποιήθηκαν με ανιχνευτή το κλωνοποιημένο γονίδιο MIR-1. Η μελέτη μας ήταν η πρώτη περιγραφή χρωμοσωμικού μηχανισμού αντοχής εγκατεστημένου σε πλασμίδιο. Μετά τη περιγραφή της MIR-1 και την ευρεία διάδοση των μοριακών τεχνικών περιγράφηκαν πολλές πλασμιδιακές AmpC και καρμπαπενεμάσες. Τα ένζυμα αυτά διευρύνουν το φάσμα αντοχής στα β-λακταμικά αντιβιοτικά που μπορεί να εξαπλωθεί σε κλινικά στελέχη μέσω της διασποράς πλασμιδίων.