Valorisation of renewable resources produced by sugarcane mills and oilseed processing industries via microbial and enzymatic processes for the production of fumaric acid, wax esters, biolubricants and oleogels

Abstract

This PhD thesis focuses on the processing and valorization of food industry raw materials, including very high polarity (VHP) cane sugar, molasses, soybean cake, and renewable resources, such as fatty acid distillates derived from vegetable oil refining processes, towards the development of novel biorefinery concepts. The aim was the production of value-added bio-economy products, which can be applied in the food industry, through bioprocess development. The chemical composition of all raw materials was initially quantified, including soluble sugars, nitrogen, protein, phenolic compounds, ash, moisture content, trace minerals and fibers. Thereafter, the proper processing methods were developed for the biotechnological production of intermediate products, such as microbial oils, and food additives, such as fumaric acid and carotenoids. Additionally, fatty acid esters and oleogels, as novel bio-based products for the food industry, were produced in the last part of this thesis.Initially, the research focused on the soybean cake processing method via the enzymatic route, aiming to the valorization of the protein content. A two-stage bioprocess was developed employing solid state fungal fermentation for the production of crude enzymes that were used for enzymatic hydrolysis of soybean cake to produce a nutrient-rich fermentation feedstock. The effect of temperature and initial enzyme activity on the hydrolysis process was evaluated through the determination of free amino nitrogen (FAN) and inorganic phosphorus concentration in the produced hydrolysate.Soybean cake hydrolysate was utilized as pre-culture fermentation medium in the cultivation of the fungal strain Rhizopus arrhizus for the production of fumaric acid. Batch and fed-batch fermentations were conducted in shake flasks for the production of fumaric acid using different raw materials, such as mixtures of glucose and fructose, VHP cane sugar and molasses. The highest fumaric acid concentration (40 g/L) with a sugar conversion yield of 0.86 g/g was achieved in a fermentation medium containing VHP cane sugar inoculated with a pre-culture medium produced with soybean cake hydrolysate at initial FAN concentration of 200 mg/L. The utilization of molasses showed that its high content in specific phenolic compounds and trace elements was inhibitory for the production of fumaric acid.Microbial oil and carotenoids production by the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides DSM 4444 was assessed using VHP cane sugar and molasses. Shake flask fermentations using VHP cane sugar led to microbial oil concentration of 8.1 g/L and total dry weight of 23.8 g/L. The effect of supplementation with phosphate salts, trace elements and commercial nitrogen sources in a molasses-based medium was evaluated in shake flask cultures for microbial oil production. Experimental results showed that 12.7 g/L microbial oil was achieved with an intracellular content of 59% (w/w), when the medium contained all the supplements. Fed-batch fermentations in bioreactor were also carried out using molasses with either commercial nitrogen sources or soybean cake hydrolysate. The highest microbial oil concentration (18.4 g/L) with an intracellular lipid content of 49.8% (w/w) and carotenoids content of 88.9 μg/g was achieved when soybean cake hydrolysate was used.Microbial oils and fatty acid distillates were subsequently used as raw materials for the production of value-added bio-based products. An enzymatic bioprocess was developed for wax esters production using oleyl, cetyl and behenyl alcohols. The enzymatic process was optimized, regarding temperature and initial enzyme concentration, using commercial (Novozyme 435, Lipozyme) and non-commercial lipases. Conversion yields up to 94% were achieved. The properties acid value, iodine value, saponification value, viscosity and thermal behavior, using differential scanning calorimetry (DSC), of the produced wax esters were evaluated, which showed comparable properties to natural waxes (e.g. carnauba wax, beeswax). Furthermore, polyol ester production was carried out using microbial oils with neopentyl glycol or trimethylolpropane polyols. The reaction was catalyzed by commercial lipases (Lipomod 34MDP) resulting inconversion yields up to 88%. The physicochemical properties of the produced polyol esters showed that they could be used as biolubricants.Finally, the produced bio-based was esters were evaluated as novel oleogelator agents for the production of oleogels. Oleogellation process was developed using extra virgin olive oil, soybean oil and microbial oil as base oils. The produced oleogels were evaluated through the analysis of color, crystal morphology, using polarised light microscopy (PLM), texture, using texture analyser, rheological and thermal behavior, using rheometer and differential scanning calorimetry, respectively. The novel oleogels produced in this study showed similar properties with spreadable fat-based products and could be a potential substitute of saturated and trans fatty acids in food products.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστίασε στην επεξεργασία πρώτων υλών της βιομηχανίας τροφίμων, όπως ακατέργαστη ζάχαρη, μελάσα, σογιάλευρο και παράπλευρα ρεύματα από την επεξεργασία εξευγενισμού των βρώσιμων ελαίων, στα πλαίσια ανάπτυξης καινοτόμων βιοδιυλιστηρίων. Ο στόχος ήταν η ανάπτυξη των κατάλληλων βιοδιεργασιών που θα οδηγήσουν στην παραγωγή νέων προϊόντων βιο-οικονομίας, με ευρεία εφαρμογή στη βιομηχανία τροφίμων. Ειδικότερα, πραγματοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισμός της χημικής σύστασης των πρώτων υλών με σκοπό να προσδιοριστούν τα κυριότερα συστατικά αυτών, όπως ελεύθερα σάκχαρα, άζωτο, πρωτεΐνη, φαινολικά συστατικά, τέφρα, περιεκτικότητα σε νερό, ιχνοστοιχεία και διαιτητικές ίνες. Με βάση τη χημική σύσταση των πρώτων υλών επιλέχθηκαν οι κατάλληλες μέθοδοι επεξεργασίας και αξιοποίησης αυτών για την βιοτεχνολογική παραγωγή ενδιάμεσων προϊόντων, όπως μικροβιακά λιπίδια, και πρόσθετων και βιολειτουργικών συστατικών τροφίμων, όπως φουμαρικό οξύ και καροτενοειδή. Επίσης, στο τελικό στάδιο της μελέτης παρήχθησαν καινοτόμα προϊόντα με ευρεία εφαρμογή στη βιομηχανία τροφίμων, όπως εστέρες λιπαρών οξέων και ελαιοπηκτές. Το πρώτο στάδιο της μελέτης εστίασε στην επεξεργασία του σογιαλεύρου με ενζυμικές βιοδιεργασίες, με στόχο την αξιοποίηση των πρωτεϊνών του σογιαλεύρου για την παραγωγή θρεπτικού μέσου κατάλληλου για μικροβιακές ζυμώσεις. Η διεργασία αυτή περιελάμβανε την παραγωγή ακατέργαστων πρωτεολυτικών ενζύμων μέσω ζύμωσης στερεής κατάστασης και χρήση των ενζύμων αυτών για την υδρόλυση του σογιαλεύρου. Η ενζυμική υδρόλυση βελτιστοποιήθηκε όσον αφορά τη θερμοκρασία υδρόλυσης και την αρχική ενζυμική ενεργότητα. Το παραχθέν υδρόλυμα σογιαλεύρου αξιολογήθηκε μέσω του χημικού προσδιορισμού του αζώτου των ελεύθερων αμινομάδων των αμινοξέων και των πεπτιδίων (free amino nitrogen - FAN) και του ανόργανου φωσφόρου.Το υδρόλυμα σογιαλεύρου χρησιμοποιήθηκε ως θρεπτικό μέσο στην προκαλλιέργεια ανάπτυξης του μυκητιακού στελέχους Rhizopus arrhizus NRRL 2582 με στόχο τη βιοτεχνολογική παραγωγή φουμαρικού οξέος. Σε αυτό το στάδιο της μελέτης πραγματοποιήθηκαν ασυνεχείς και ημι-συνεχείς ζυμώσεις σε αναδευόμενες φιάλες χρησιμοποιώντας διαφορετικές πρώτες ύλες, όπως μείγμα εμπορικής γλυκόζης-φρουκτόζης, ακατέργαστη ζάχαρη και μελάσα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μεγαλύτερη παραγωγή φουμαρικού οξέος (40 g/L) με απόδοση 0,86 g/g επιτεύχθηκε στο υπόστρωμα ακατέργαστης ζάχαρης. Ο συνδυασμός υδρολύματος σογιαλεύρου και μελάσας δεν επέφερε ανάλογα αποτελέσματα, καθώς ο μεταβολισμός του μύκητα R. arrhizus στράφηκε προς την παραγωγή αιθανόλης. Επιπρόσθετα, ο ποσοτικός προσδιορισμός της σύστασης της μελάσας έδειξε ότι περιέχει σημαντικές ποσότητες συγκεκριμένων φαινολικών συστατικών και αυξημένη περιεκτικότητα ιχνοστοιχείων που επηρεάζουν το μεταβολισμό των μυκήτων του γένους Rhizopus. Στη συνέχεια μελετήθηκε η δυνατότητα παραγωγής μικροβιακών λιπιδίων και καροτενοειδών από την ζύμη Rhodosporidium toruloides DSM 4444. Κατά την μελέτη ασυνεχών ζυμώσεων που πραγματοποιήθηκαν σε αναδευόμενες φιάλες με υπόστρωμα ακατέργαστης ζάχαρης, η μεγαλύτερη παραγωγή μικροβιακών λιπιδίων ήταν 8,1 g/L με 23,8 g/L ξηρή κυτταρική μάζα. Ακολούθησαν ασυνεχείς ζυμώσεις με στόχο την μελέτη της επίδρασης διαφορετικών θρεπτικών συστατικών (π.χ. φωσφορικών αλάτων και ιχνοστοιχείων) στην παραγωγή μικροβιακών λιπιδίων. Τα καλύτερα αποτελέσματα (12,7 g/L συγκέντρωση μικροβιακών λιπιδίων με 59% κ.β. λιποπεριεκτικότητα) σημειώθηκαν με την προσθήκη τόσο των φωσφορικών αλάτων όσο και του μείγματος των ιχνοστοιχείων. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν ημι-συνεχείς ζυμώσεις σε βιοαντιδραστήρα σε υπόστρωμα μελάσας με χρήση εμπορικών πηγών αζώτου ή υδρολύματος σογιαλεύρου. Η χρήση υδρολύματος σογιαλεύρου σε ημι-συνεχείς ζυμώσεις οδήγησε στη μεγαλύτερη παραγωγή μικροβιακών λιπιδίων (18,4 g/L) με ταυτόχρονη παραγωγή καροτενοειδών με μέγιστη περιεκτικότητα 88,9 μg/g ξηρής κυτταρικής μάζας.Ακολούθως, η ερευνητική μελέτη επικεντρώθηκε στην παραγωγή διαφόρων χημικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας, ως καινοτόμες εφαρμογές της χρήσης μικροβιακών λιπιδίων αλλά και της αξιοποίησης και επεξεργασίας των παράπλευρων ρευμάτων που προκύπτουν από τον εξευγενισμό των φυτικών ελαίων. Αρχικά, η ενζυμική μετατροπή των μικροβιακών και φυτικής προέλευσης λιπιδίων για την παραγωγή εστέρων μελετήθηκε με την χρήση ελαϊκής, παλμιτικής και βεχενυλικής αλκοόλης. Οι εστέρες αυτοί που παράγονται από αλκοόλες μεγάλης ανθρακικής αλυσίδας ονομάζονται κηροί. Πραγματοποιήθηκε βελτιστοποίηση της ενζυμικής διεργασίας ως προς την θερμοκρασία και την αρχική ενζυμική ενεργότητα με χρήση εμπορικών (Novozyme 435, Lipozyme) και μη εμπορικών λιπασών, που οδήγησαν σε εξαιρετικά υψηλές αποδόσεις βιομετατροπής, έως και 94%. Μελετήθηκαν οι χημικές και φυσικές ιδιότητες των παραγόμενων βιογενών κηρών, όπως οξύτητα, αριθμός ιωδίου, αριθμός σαπωνοποποίησης, ιξώδες και θερμική συμπεριφορά με χρήση θερμιδομετρίας σάρωσης (differential scanning calorimetry, DSC), και βρέθηκαν παρόμοιες με αυτές των ευρέως χρησιμοποιούμενων φυτικών κηρών (π.χ. καρναουβικός κηρός, κηρός μέλισας κ.α.). Εν συνεχεία, η παραγωγή εστέρων με βιολιπαντικές ιδιότητες από μικροβιακά λιπίδια πραγματοποιήθηκε με χρήση των πολυολών νεοπεντυλογλυκόλη και τριμεθυλοπροπάνιο. Η ενζυμική αντίδραση καταλύθηκε από εμπορικές λιπάσες (Lipomod 34MDP) και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο μέγιστος βαθμός εστεροποίησης που επιτεύχθηκε ήταν 88%, ενώ η καταλληλότητά τους για χρήση ως βιολιπαντικές ουσίες επιβεβαιώθηκε μέσω της μελέτης των ιδιοτήτων των εν λόγω εστέρων.Στο τελευταίο στάδιο της διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε η ανάπτυξη ελαιοπηκτωμάτων ως καινοτόμος εφαρμογή των παραχθέντων βιογενών κηρών. Οι ελαιώδεις βάσεις για την παραγωγή ελαιοπηκτωμάτων ήταν ελαιόλαδο, σογιέλαιο και μικροβιακά λιπίδια, ενώ οι βιογενείς κηροί που χρησιμοποιήθηκαν προέρχονταν είτε από μικροβιακά λιπίδια είτε από παράπλευρα ρεύματα εξευγενισμένων ελαίων. Η αξιολόγηση των ελαιοπηκτωμάτων πραγματοποιήθηκε μέσω της μελέτης των ιδιοτήτων τους, όπως το χρώμα, η κρυσταλλική μορφή μέσω μικροσκοπίου πολωμένου φωτός (polarised light microscopy, PLM), η υφή μέσω αναλυτή υφής (texture analyser), η ρεολογική και η θερμική συμπεριφορά, με χρήση ρεομέτρου και θερμιδομετρία σάρωσης, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ιδιότητες των παραχθέντων ελαιοπηκτών ομοιάζουν με εκείνες τροφίμων, όπως λιπαρές ύλες επικάλυψης, και δύναται να χρησιμοποιηθούν ως υποκατάστατα κορεσμένων και trans λιπαρών υλών σε προϊόντα τροφίμων.