Μεταβολές των ποιοτικών και βιοχημικών χαρακτηριστικών του σάλιου σε συσχέτιση με τη μεταβολική ρύθμιση σε παιδιά και εφήβους με διαβήτη τύπου 1

Abstract

This thesis focuses on the salivary characteristics of children and adolescents with type 1 diabetes in relation to the level of glycemic control, with the aim to investigate their oral health status and at a further level of analysis, explore the salivary proteome of this study group. The thesis consists of two separate partsPart I: The aim of this cross-sectional study was to investigate the possible association between salivary dysfunction, xerostomia prevalence and incidence of caries, in relation to the level of metabolic control, in children and adolescents with type 1 diabetes. For the purpose of this study, a total of 150 children and adolescents (10-18 years old) were examined and allocated among 3 groups: 50 patients poorly-controlled (HbA1c≥7.5%), 50 well-controlled (HbA1c<7.5%) and 50 age- and sex-matched healthy controls. The study was approved by the Research Ethics Committee of the National and Kapodistrian University of Athens and the parents signed written informed consent. All subjects were examined for dental caries, oral hygiene and salivary factors. Assessments of salivary characteristics included self-reported xerostomia, quantification of resting and stimulated whole saliva flow rates, pH values, buffering capacity and saliva’s viscosity. A questionnaire and a chair-side saliva testing kit were used for the evaluation of salivary function. Caries incidence was recorded using DMFT index. Plaque index and gingival index were additionally evaluated. Data were analysed by Chi-square and Kruskal-Wallis tests. Higher caries levels, higher prevalence of xerostomia and a decreased unstimulated salivary flow rate were recorded in poorly-controlled diabetics. The average caries indexes were DMFT(poor c) 3.6, DMFT(well c)1.2, DMFT(healthy) 1.5, p < 0.05). Salivary status and caries index were not found to be significantly different between well-controlled patients and healthy controls. The results of this study indicated that chair-side salivary tests provide the practitioners with an easy-to use and quick method for the evaluation of salivary function and caries risk assessment in young patients with diabetes. Part II: In this part of our study we investigated the proteomic profile of whole saliva by high resolution mass spectrometry in type 1 diabetic patients. The aim of this research was to characterize the salivary proteome of type 1 diabetes patients in order to identify differentially expressed proteins compared to control subjects, infer deregulated biological pathways, and evaluate the relevance of the findings in the context of diabetes pathophysiology. We analyzed by high resolution mass spectrometry approaches saliva samples collected from 32 children and adolescents: 12 with poorly controlled type 1 diabetes (G1) (HbA1c≥7.5%), 12 with well controlled type 1 diabetes (G2) (HbA1c<7.5%) and 12 healthy controls (Ctrl). According to the results of this study, the composition of the salivary proteome is affected by pathological conditions. The list of more than 2000 high confidence protein identifications constitutes a comprehensive characterization of the salivary proteome. Patients with good glycemic regulation and healthy individuals have comparable proteomic profiles. In contrast, a significant number of differentially expressed proteins were identified in the saliva of patients with poor glycemic regulation compared to patients with good glycemic control and healthy children. These proteins are involved in biological processes relevant to diabetic pathology such as endothelial damage and inflammation. Moreover, a putative preventive therapeutic approach was identified based on bioinformatic analysis of the deregulated salivary proteins. Thus, thorough characterization of saliva proteins in diabetic pediatric patients established a connection between molecular changes and disease pathology. This proteomic and bioinformatic approach highlights the potential of salivary diagnostics in diabetes pathology and opens the way for preventive treatment of the disease.

Ο Σακχαρώδης Διαβήτης (ΣΔ) είναι η πιο κοινή νόσος των ενδοκρινών αδένων στο γενικό πληθυσμό. Ο Ινσουλινοεξαρτώμενος ή τύπου 1 ΣΔ προκαλείται από την επίδραση διαφόρων περιβαλλοντικών παραγόντων που ενεργοποιούν τον αυτοάνοσο μηχανισμό καταστροφής των β-κυττάρων του παγκρέατος σε γενετικά προδιατεθειμένο άτομο. Η οδοντοστοματολογική υγεία των ατόμων με ΣΔ έχει αποτελέσει αντικείμενο πολλών μελετών που αναφέρονται στην εμφάνιση τερηδόνας και περιοδοντικής νόσου, εξετάζοντας διάφορους παράγοντες που πιθανόν να συμβάλλουν ή όχι στην εμφάνιση και εξέλιξη των νόσων αυτών.Ο πρώτος σκοπός της παρούσας κλινικής μελέτης ήταν να διερευνηθεί η συσχέτιση του μεταβολικού ελέγχου με ποιοτικά και ποσοτικά χαρακτηριστικά του σάλιου (ροή, pH, σύσταση, ρυθμιστική ικανότητα) σε παιδιά και εφήβους με Τύπου 1 ΣΔ (Τ1ΣΔ) καθώς και με την εμφάνιση τερηδόνας στους ασθενείς αυτούς. Ο δεύτερος σκοπός της μελέτης ήταν η διερεύνηση του πρωτεωμικού προφίλ των παιδιών με Τ1ΣΔ για την ανίχνευση πιθανών σιαλικών βιομορίων που θα μπορούσαν να αποτελέσουν στο μέλλον διαγνωστικά εργαλεία για τον εντοπισμό αλλά και την παρακολούθηση της μεταβολικής ρύθμισης ασθενών με Τ1ΣΔ.Για τους σκοπούς αυτούς, η μελέτη χωρίστηκε σε δύο μέρη. Κατά το πρώτο μέρος, εξετάστηκαν 150 παιδιά και έφηβοι (10-18), εκ των οποίων 50 εμφάνιζαν αρρύθμιστο Τ1ΣΔ (HbA1c≥7.5%), 50 ρυθμισμένο Τ1ΣΔ (HbA1c<7.5%) και 50 ήταν υγιείς μάρτυρες. To δείγμα της μελέτης προήλθε από τους ασθενείς που παρακολουθούνται στο Διαβητολογικό Κέντρο του Νοσοκομείου Παίδων «Π & Α Κυριακού» και η συλλογή του δείγματος γινόταν κατά τη διάρκεια της τριμηνιαίας παρακολούθησής τους.Οι 3 ομάδες μελετήθηκαν ως προς τα επιμέρους χαρακτηριστικά του σάλιου και την επίπτωση της τερηδόνας, χρησιμοποιώντας το δείκτη DMFT. Για τις 2 ομάδες των ασθενών με Τ1ΣΔ μετρήθηκε επιπρόσθετα η γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη (HbA1c) για να υπολογιστεί το επίπεδο ρύθμισης του ΣΔ και καταγράφηκε ο χρόνος διάγνωσης του ΣΔ για να υπολογιστεί η διάρκεια της νόσου. Κοινωνικοοικονομικές παράμετροι, επίπεδο στοματικής υγιεινής, συχνότητα επίσκεψης στον οδοντίατρο και διατροφικές συνήθειες διερευνήθηκαν κατά την επιλογή του δείγματος ώστε οι συμμετέχοντες να παρουσιάζουν μια κατά το δυνατόν ομοιογενή εικόνα ως προς αυτές τις παραμέτρους. Μεταξύ των κριτηρίων συμμετοχής των ασθενών στη μελέτη ήταν: η απουσία από το ιατρικό ιστορικό άλλων νοσημάτων που επηρεάζουν τη ροή του σάλιου, η μη λήψη φαρμάκων που επηρεάζουν τη ροή του σάλιου, η μη λήψη αντιβιοτικών και αντιμικροβιακών φαρμάκων για 15 μέρες πριν την κλινική εξέταση, η μη χρήση μέσων στοματικής υγιεινής με αντιμικροβιακές ουσίες όπως χλωρεξιδίνη.Η αξιολόγηση των ποιοτικών και ποσοτικών χαρακτηριστικών του σάλιου έγινε με βάση το σκεύασμα GC Saliva Check Buffer (3Μ ESPE). Στα χαρακτηριστικά που μελετήθηκαν περιλαμβάνονται η σύσταση, το pH σάλιου ηρεμίας και διέγερσης, η ροή σάλιου σε κατάσταση ηρεμίας και σε κατάσταση διέγερσης καθώς και η ρυθμιστική ικανότητα του σάλιου. Η σύσταση του σάλιου αξιολογήθηκε στις βαθμίδες ορώδες σάλιο χαμηλού ιξώδους, φυσαλιδώδες σάλιο αυξημένου ιξώδους και κολλώδες σάλιο αυξημένου ιξώδους. Ακολούθως, το κάτω χείλος στεγνώθηκε με γάζα και παρατηρήθηκε η δημιουργία σταγονιδίων σάλιου στα στόμια των ελασσόνων σιελογόνων αδένων του χείλους για να αξιολογηθεί η ροή σε κατάσταση ηρεμίας. Αξιολογήθηκαν στη συνέχεια το pH του σάλιου ηρεμίας, η ροή του σάλιου διέγερσης μετά από μάσηση κύβου παραφίνης και το pH και ρυθμιστική ικανότητα του σάλιου διέγερσης. Καταγράφηκαν επιπρόσθετα ο δείκτης πλάκας, ο δείκτης τερηδόνας DMFT καθώς και η υποκειμενική αίσθηση ξηρότητας του στόματος με τη συμπλήρωση ερωτηματολογίου αξιολόγησης της ξηροστομίας. Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων έγινε με τις δοκιμασίες χ2 και Kruskal-Wallis σε επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας p<0.05.Η ροή και το pH σάλιου ηρεμίας, η σύσταση του σάλιου και η τερηδονική κατάσταση των ασθενών με μη ρυθμισμένο Τ1ΣΔ βρέθηκαν να διαφέρουν σε στατιστικά σημαντικό βαθμό (p<0.05) σε σύγκριση με τις τιμές των ασθενών με ρυθμισμένο Τ1ΣΔ, που παρουσίαζαν χαρακτηριστικά παρόμοια με αυτά των υγιών μαρτύρων. Παρά το ότι η ροή στο σάλιο ηρεμίας και διέγερσης δε φάνηκε να διαφέρει μεταξύ ρυθμισμένων και υγιών μαρτύρων, οι μεταβολικά ρυθμισμένοι ασθενείς με Τ1ΣΔ ανέφεραν ξηροστομία σε μεγαλύτερη συχνότητα από τους υγιείς, όπως και οι αρρύθμιστοι ασθενείς. Συμπερασματικά, η μεταβολική ρύθμιση των παιδιών και εφήβων με Τ1ΣΔ φάνηκε να επηρεάζει σημαντικά τα ποιοτικά και ποσοτικά χαρακτηριστικά του σάλιου και είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της οδοντοστοματικής τους υγείας. Η αξιολόγηση των χαρακτηριστικών αυτών με τη βοήθεια ενός εύχρηστου Kit δίνει τη δυνατότητα στους κλινικούς κάθε ειδικότητας, χωρίς να απαιτείται ειδικός εξοπλισμός ή οδοντιατρικές γνώσεις, να εντοπίσουν εύκολα, γρήγορα και έγκαιρα παιδιά με αυξημένο κίνδυνο για εμφάνιση τερηδόνας και αντίστοιχα να τα ενεργοποιήσουν προς την κατεύθυνση της οδοντιατρικής φροντίδας και πρόληψης. Το δεύτερο μέρος της μελέτης περιελάμβανε την ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης του σάλιου, προκειμένου να εντοπιστούν τυχόν διαφορές στην πρωτεϊνική έκφραση μεταξύ υγιών και πασχόντων, και πραγματοποιήθηκε με την εφαρμογή των δοκιμασιών υγρής χρωματογραφίας/ φασματογραφίας μάζας σε σειρά (liquid chromatography/tandem mass spectrometry) ώστε να διερευνηθεί το «πρωτεωμικό» προφίλ του σάλιου μεταξύ των διαφορετικών ομάδων ασθενών. Η δοκιμασία ΜRM εφαρμόστηκε στη συνέχεια για να επιβεβαιώσει τη διαφορετική έκφραση συγκεκριμένων πρωτεϊνικών μορίων, με βάση τα αποτελέσματα της χρωματογραφίας. 32 παιδιά και έφηβοι συμμετείχαν σε αυτό το τμήμα της μελέτης: 12 με αρρύθμιστο Τ1ΣΔ (G1) (HbA1c≥7.5%), 12 με καλή ρύθμιση του Τ1ΣΔ (G2) (HbA1c<7.5%) και 12 υγιείς μάρτυρες (Ctrl). Συνολικά, ταυτοποιήθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν 4877 πρωτεΐνες, με τη χρήση του Trans Proteomic Pipeline, λογισμικού ανάλυσης και επεξεργασίας των αποτελεσμάτων της φασματομετρίας. Η ταυτοποίηση των πρωτεϊνών έγινε με στάθμη εμπιστοσύνης 95%. 2031 πρωτεΐνες ήταν παρούσες σε ποσοστό μεγαλύτερο ή ίσο του 70% στο σύνολο της κάθε ομάδας. Για τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό R και ο έλεγχος κανονικότητας κατανομής έγινε με το Kolmogorov- Smirnov Test. Διπλό κριτήριο στατιστικής σημαντικότητας εφαρμόστηκε κατά την ανάλυση αυτή: t test p-value και Log2ratio p-value <0.05. 33 πρωτεΐνες βρέθηκαν με διαφορετική έκφραση μεταξύ των ομάδων G1-Ctrl, 37 πρωτεΐνες μεταξύ των G2-Ctrl, και 61 πρωτεΐνες μεταξύ των G1-G2. Με βάση τα αποτελέσματα της μελέτης, το πρωτεωμικό προφίλ των συμμετεχόντων φάνηκε ικανό να μπορεί να διαχωρίσει τους ασθενείς ανάλογα με τη μεταβολική τους ρύθμιση. Το πρωτεωμικό προφίλ των ρυθμισμένων ασθενών βρέθηκε παρόμοιο με αυτό των υγιών και στατιστικά σημαντικά διαφορετικό από αυτό των αρρύθμιστων. Παράλληλα, βιολογικά μονοπάτια επιπλοκών που παρουσιάζονται στην ενήλικη ζωή εντοπίστηκαν ενεργοποιημένα ήδη από την παιδική ηλικία στους αρρύθμιστους ασθενείς. Τέλος, με την εφαρμογή ειδικού λογισμικού βιοπληροφορικής ανάλυσης στις πρωτεΐνες που βρέθηκαν να έχουν διαφορετική έκφραση μεταξύ των ομάδων, προτείνεται μια πιθανή προληπτική προσέγγιση που θα μπορούσε να αποτελέσει πεδίο μελλοντικής διερεύνησης.