Διερεύνηση της προγνωστικής και προβλεπτικής σημασίας επιγενετικών βιοδεικτών στον καρκίνο του μαστού και άλλους γυναικολογικούς καρκίνους

Abstract

DNA methylation is the most widely studied epigenetic mechanism. In cancer, aberrant methylation is usually observed in tumor suppressor and metastasis suppressor gene promoters, resulting in loss of their protective role. It has been demonstrated that the abnormal methylation patterns of DNA found in tumors can also be detected in biomaterials of «liquid biopsy» of patients and can be therefore evaluated as minimally invasive biomarkers of clinical value. Circulating Cell-Free DNA (ccfDNA) can be easily isolated from biological fluids such as plasma/serum. Thus, numerous studies are being contacted in order to identify and validate DNA methylation signatures on ccfDNA. In order to detect and evaluate such biomarkers, we studied gene specific DNA methylation patterns in cervical and breast cancer. Our study was implemented in three distinct parts. In uterine cervix, it has been proved that High Risk Human Papillovirus (HRHPV) infection can cause aberrant DNA methylation. We assessed for the first time DNA methylation of the cancer-related genes BRMS1 and WNT5A in cervical smears of 64 women with no infection by HRHPV, 70 women with proven HRHPV infection and in cervical tissue biopsies using quantitative Methylation specific PCR (qMSP). Methylation of BRMS1 promoter was detected statistically significant more often in women with no HRHPV infection in relation to women with HRHPV infection or pathological histology. On the contrary, methylation of WNT5A promoter was detected statistically significant more frequently in women with HRHPV infection and pathological histology. Furthermore, we studied the protein expression of BRMS1 using immunohistochemistry in biopsies of cervical tissue which revealed nuclear BRMS1 protein staining in normal HRHPV–free cervix, in intraepithelial neoplasia and in malignant tissue, where staining was occasionally also cytoplasmic. In cancer, expression was stronger in the more differentiated cancer blasts and was lost in low differentiated cancer blasts, probably due to DNA methylation. In the second part, we analyzed the kinetics and release mechanism of ccfDNA in vitro. The study was conducted in cultures of HeLa and MCF-7 cells. Normalized indexes of ccfDNA per cell population decreased over time of culture but were significantly elevated after exposure to the IC50 doses of 5‐azacytidine (5‐AZA‐CR). Fragment‐size profiling was indicative of active release, whereas exposure to 5‐AZA‐CR induced the release of additional shorter fragments, indicative of apoptosis. Also, using qMSP, we observed that the DNA methylation profile of SOX17, WNT5A, MSH2, KLK10 and GATA3 in cells gDNA was identical to the corresponding ccfDNA and followed accurately changes caused by 5‐AZA‐CR.In breast cancer, we evaluated the prognostic and predictive potential of ccfDNA related parameters. Groups consisted of 150 and 16 breast cancer patients under adjuvant and neoadjuvant therapy respectively, 34 patients with metastatic disease and 35 healthy volunteers. Direct quantification of ccfDNA in plasma revealed elevated concentrations correlated to the incidence of death, shorter PFS and non-response to pharmacotherapy in patients with metastatic breast cancer. Also, greater number of ccfDNA fragments was associated with elevated levels of ccfDNA, tumor size and incidence of death. The methylation status of studied genes KLK10, SOX17, WNT5A, MSH2 except for GATA3 was more frequently methylated in all patient groups than in healthy individuals. Furthermore, statistically significant differences were observed between the methylation status of WNT5A, KLK10 and SOX17 genes with the clinicopathological characteristics and the course of the disease. Classification analysis by a fully automated, machine learning software produced a single-parametric linear model using ccfDNA plasma concentration values, with great discriminating power to predict response to pharmacotherapy (AUC 0.803, 95% CI [0.606, 1.000]) in the metastatic group. Two more multi-parametric signatures were produced for the metastatic group, predicting survival and disease outcome. Finally, a multiple logistic regression model was constructed, discriminating between patient groups and healthy individuals. Upon prospective clinical evaluation, all the classifiers produced could aid accurate prognosis and prediction in metastatic breast cancer.Overall, our study greatly enriches knowledge about ccfDNA biology in cancer and reveals its significance as a liquid biopsy biomaterial. We believe that specific methylation patterns as detected in either cervical smears or ccfDNA may be minimally invasive epigenetic /pharmacoepigenetic biomarkers that will assist the clinical management of the studied neoplasms.

Η DNA μεθυλίωση αποτελεί τον καλύτερα μελετημένο επιγενετικό μηχανισμό. Στον καρκίνο παρατηρείται παρεκκλίνουσα μεθυλίωση συνήθως στους υποκινητές ογκοκατασταλτικών γονιδίων και καταστολέων της μετάστασης με αποτέλεσμα την απώλεια του προστατευτικού τους ρόλου. Έχει αποδειχθεί ότι τα μη φυσιολογικά πρότυπα DNA μεθυλίωσης που υπάρχουν στις κακοήθειες μπορούν να ανιχνευτούν στα βιοϋλικά της «υγρής βιοψίας» των ασθενών και ως εκ τούτου θα μπορούσαν να αξιολογηθούν περαιτέρω ως ελάχιστα επεμβατικοί βιοδείκτες με κλινική αξία. Το κυκλοφορούν ελεύθερο κυττάρων DNA (ccfDNA) μπορεί εύκολα να απομονωθεί από βιολογικά υγρά όπως το πλάσμα/ορό. Ως εκ τούτου, πλήθος ερευνών πραγματοποιούνται με σκοπό την ταυτοποίηση και αξιολόγηση υπογραφών της DNA μεθυλίωσης. Θέλοντας να ανιχνεύσουμε και να αξιολογήσουμε τέτοιου είδους βιοδείκτες, μελετήσαμε το προφίλ της DNA μεθυλίωσης γονιδίων στον καρκίνο του τραχήλου και του μαστού. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε τρία διακριτά μέρη.Στον τράχηλο της μήτρας έχει αποδειχθεί ότι η μόλυνση από τα υψηλού κινδύνου στελέχη των υποτύπων του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων (ΗRHPV) μπορεί να προκαλέσει την παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA. Στην παρούσα μελέτη αξιολογήσαμε για πρώτη φορά τη DNA μεθυλίωση των γονιδίων BRMS1 και WNT5A σε τραχηλικά επιχρίσματα 64 γυναικών χωρίς μόλυνση από τα στελέχη HRHPV, σε 70 γυναίκες με αποδεδειγμένη μόλυνση από τα στελέχη HRHPV και σε βιοψίες τραχηλικού ιστού χρησιμοποιώντας ποσοτική ειδική για την μεθυλίωση PCR (qMSP). Η μεθυλίωση του BRMS1 ανιχνεύθηκε στατιστικώς σημαντικά συχνότερα στις γυναίκες χωρίς λοίμωξη από τους HRHPV σε σχέση με τις γυναίκες με λοίμωξη από τους HRHPV ή με παθολογική ιστολογία. Το αντίθετο παρατηρήθηκε στη περίπτωση του WNT5A όπου ανιχνεύθηκε στατιστικώς σημαντικά συχνότερα μεθυλιωμένο στις γυναίκες με λοίμωξη από τους HRHPV και με παθολογική ιστολογία. Επιπλέον αναλύθηκε η πρωτεϊνική έκφραση του BRMS1 με ανοσοϊστοχημεία σε βιοψίες τραχηλικού ιστού όπου αποκάλυψε πυρηνική θετική χρώση στο φυσιολογικό χωρίς HRHPV μόλυνση επιθήλιο, στις ενδοεπιθηλιακές αλλοιώσεις και στον καρκινικό ιστό, όπου παρατηρήθηκε και περιστασιακή κυτταροπλασματική χρώση. Στον καρκίνο, η έκφραση ήταν ισχυρότερη στις περισσότερο διαφοροποιημένες καρκινικές βλάστες, ενώ απουσίαζε στις καρκινικές βλάστες χαμηλής διαφοροποίησης όπου πιθανόν να σχετίζεται με τη μεθυλίωση του γονιδίου. Τα αποτελέσματά μας αναδεικνύουν την αξία της προσθήκης επιγενετικών βιοδεικτών στα προγράμματα πρόληψης και στην κλινική διαχείριση του καρκίνου του τραχήλου.Στο δεύτερο μέρος, αναλύσαμε την κινητική και το μηχανισμό απελευθέρωσής του ccfDNA in vitro. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε καλλιέργειες HeLa και MCF-7 κυττάρων. Οι κανονικοποιημένοι δείκτες της συγκέντρωσης του ccfDNA ανά κυτταρικό πληθυσμό μειώθηκαν με το χρόνο της καλλιέργειας αλλά αυξήθηκαν στατιστικώς σημαντικά έπειτα από έκθεση των κυττάρων στην IC50 δόση του αποπτωτικού/απομεθυλιωτικού παράγοντα 5-Aζακετιδίνη. Η κατανομή των θραυσμάτων του ccfDNA ήταν αντιπροσωπευτική της ενεργής απελευθέρωσης, ενώ η έκθεση στην 5-Aζακετιδίνη προκάλεσε την παραγωγή αποπτωτικών θραυσμάτων. Επιπλέον, έπειτα από ανάλυση με qMSP, παρατηρήσαμε ότι το προφίλ της DNA μεθυλίωσης των γονιδίων SOX17, WNT5A, MSH2, KLK10 και GATA3 στο γενωμικό DNA (gDNA) των κυττάρων διατηρείται στο αντίστοιχο ccfDNA πριν και μετά την έκθεση στην 5-Aζακετιδίνη. Η παρούσα μελέτη εξέτασε για πρώτη φορά τη διατήρηση της DNA μεθυλίωσης στο ccfDNA μετά την απελευθέρωση του in vitro. Τα αποτελέσματα αυτά εμπλουτίζουν τη γνώση σχετικά με τη βιολογία του ccfDNA και ενισχύουν την αξιοπιστία του ως ένα κλινικά χρήσιμο βιοϋλικό. Στον καρκίνο του μαστού μελετήσαμε την προγνωστική και προβλεπτική δυναμική παραμέτρων του ccfDNA. Η ομάδες αποτελούνταν από 150 και 16 ασθενείς με καρκίνο του μαστού, υπό επικουρική και προ-εγχειρητική θεραπεία αντιστοίχως, 34 ασθενείς με μεταστατική νόσο και 35 υγιείς εθελοντές. Η απευθείας ποσοτικοποίηση του ccfDNA στο πλάσμα υπέδειξε αυξημένη συγκέντρωση η οποία συσχετίστηκε με τη συχνότητα των θανάτων, το βραχύτερο διάστημα ελεύθερο προόδου νόσου και την απουσία ανταπόκρισης στη φαρμακοθεραπεία στην ομάδα των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο. Επιπλέον, ο μεγαλύτερος αριθμός θραυσμάτων του ccfDNA σχετίστηκε με τα αυξημένα επίπεδα ccfDNA, το μέγεθος του όγκου και τη συχνότητα των θανάτων. Η κατάσταση μεθυλίωσης των εξεταζόμενων γονιδίων SOX17, MSH2, KLK10, WNT5A εκτός του GATA3, ανιχνεύτηκε συχνότερα θετική στο ccfDNA σε όλες τις ομάδες ασθενών από ότι στα υγιή άτομα. Επιπλέον, προέκυψαν στατιστικώς σημαντικές συσχετίσεις της μεθυλίωσης των γονιδίων WNT5A, KLK10 και SOX17 με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά και τη πορεία της νόσου. Η ανάλυση ταξινόμησης με ένα πλήρως αυτοματοποιημένο λογισμικό μηχανικής μάθησης παρήγαγε ένα μονοπαραγοντικό γραμμικό μοντέλο για την συγκέντρωση του ccfDNA στο πλάσμα με μεγάλη διακριτική ισχύ για την πρόβλεψη ανταπόκρισης στη φαρμακοθεραπεία (AUC 0,803, 95% CI [0,606, 1,000]) στην ομάδα των μεταστατικών ασθενών. Δύο επιπλέον πολυπαραγοντικές υπογραφές παρήχθησαν για την ομάδα των μεταστατικών ασθενών. Τέλος, κατασκευάστηκε ένα μοντέλο πολλαπλής λογιστικής παλινδρόμησης που διέκρινε τους ασθενείς από τους υγιείς. Έπειτα από προοπτική κλινική αξιολόγηση, όλοι οι παραγόμενοι ταξινομητές πιθανόν να βοηθήσουν στην ακριβή πρόγνωση και πρόβλεψη στον μεταστατικό καρκίνο του μαστού.Συνολικά, η μελέτη μας εμπλουτίζει σημαντικά τη γνώση σχετικά με τη βιολογία του ccfDNA στον καρκίνο και αποδεικνύει ότι αποτελεί πολύτιμη πηγή βιολογικού υλικού υγρής βιοψίας. Θεωρούμε ότι ειδικά μοτίβα μεθυλίωσης όπως ανιχνεύονται είτε στο τραχηλικό επίχρισμα είτε στο ccfDNA μπορεί να αποτελούν ελάχιστα επεμβατικούς επιγενετικούς/φαρμακοεπιγενετικούς βιοδείκτες, που θα συνδράμουν στην κλινική διαχείριση των υπό μελέτη νεοπλασιών.