Ανάπτυξη πρότυπων βιοαισθητήτων για τον προσδιορισμό βιοτοξικών ουσιών στο γάλα και στο νερό

Abstract

The biosensors have important role in science of chemical analysis in the field of electrochemical methods. Their application in rapid detection of toxins in types, we consume in our daily lives, is particularly useful for public health. The main characteristics of evaluation of biosensors is the high sensitivity, high selectivity, the quick response and the reusability. Analysis of the real samples need additionally a method of evaluating the rate of recovery that is the fractional difference of signal between real and simulated samples. The advantages of the use of biosensors are part of the easy construction, portability and low cost. The provision of analytical results of biosensors is similar to that of other far more expensive methods of instrumental chemical analysis.In this thesis developed a principle flow injection biosensor (velocity at 2 ml/min) for detection of cholera toxin in aqueous fractions of samples (10 μL or 20 μL).). The biosensor constructed by depositing copper-coated graphene nanoparticles with integrated lipid membranes (BLMs), modified with native GM1 receptors. In the proposed biosensor, regeneration was checked every 6 minutes with 10 successful regenerations retaining its original potency. Control of the biosensor in simulated samples of lake waters was successful and no significant changes were observed under the influence of 7 conventional inhibitors introduced into the samples. The appropriate environment to perform the measurements was set at pH = 7. The biosensor was tested in a dynamic range of the toxin (10nM-10μM) and the detection limit was determined to (LOD = 1nM). This biosensor was studied also in 10 samples of real lake water and the recovery rate was calculated at two concentrations of Toxin (Low 50 nM and High 7 μM). The recovery rates found are acceptable according to the ICH2005 criteria for the suitability of the biosensor for use in repeated water monitoring.Three standard aptasensors were then developed to detect Aflatoxin (AFM1) in milk. The first Label-free aptasensor was made by surface deposition of dendrimer (PAMAM-4G) on a gold electrode where an amino-transformed aptamer -receptor was immobilized. This aptasensor was used as an electrode in the instrumental analysis of the electrochemical impedance spectroscopy (EIS). Control was performed on simulated milk samples at a dynamic range of toxin concentration (15-120 ng/l) and the toxin detection limit was determined at (LOD = 8.47 ng/l). Also, the aptasensor tested in real samples at the same dynamic range with a similar limit of detection and signal recovery greater than 78%.The second aptasensor was made by surface deposition of Neutravidin/Fe-COOH on a gold electrode, where a modified aptamer-receptor with biotin was immobilized. This aptasensor was used as an electrode in the instrumental method of Differential Pulse Voltammetry (DPV). Control was performed on simulated milk samples at a dynamic range of toxin concentration (15-120 ng / l) and the toxin limit of detection was determined at (LOD = 8.52 ng / l). This aptasensor also has the innovative element of the small laboratory manufacturing time (about 3 hours).Finally, an aptasensor was constructed by immobilizing modified aptamer with methylene blue (receptor) that mixed with mercaptohexanol. This sensor was used as an electrode in the instrumental method of Differential Pulse Voltammetry (DPV). Control was performed on simulated milk samples at a dynamic range of toxin concentration (31.45-3145 ng / l) and a limit of detection of the toxin in (LOD = 37.7 ng/l) was found. This particular aptasensor exhibited large standard deviations in the calibration curves and was therefore characterized as a subject of further study. However, the limit of detection is comparable to past data.The limits of detection (LODs) in the three aptasensors are below the permitted limit either in the EU (47 ng / l) or in the USA (472 ng / l) and can be qualified as good aptasensors in a detection of Aflatoxin M1 in milk.

Οι βιοαισθητήρες έχουν ένα σημαντικό ρόλο στην επιστήμη της χημικής ανάλυσης κυρίως στο πεδίο των ηλεκτροχημικών μεθόδων. Τα κύρια χαρακτηριστικά των βιοαισθητήρων, που τους τοποθετούν στις πλέον σύγχρονες τεχνικές της χημικής ανάλυσης, είναι η υψηλή ευαισθησία, η μεγάλη εκλεκτικότητα, η γρήγορη απόκριση και η επαναχρησιμότητα. Σε αναλύσεις πραγματικών δειγμάτων κρίνεται επιπλέον ως απαραίτητη μέθοδος αξιολόγησης το ποσοστό της ανάκτησης, δηλαδή η κλασματική διαφορά του σήματος μεταξύ των πραγματικών και των πρότυπων δειγμάτων. Στα πλεονεκτήματα της ανάπτυξης και χρήσης των βιοαισθητήρων για εμπορικούς σκοπούς, εντάσσονται η εύκολη κατασκευή, η φορητότητά τους και το χαμηλό κόστος. Η αναλυτική αξιοπιστία των βιοαισθητήρων είναι παρόμοια με αυτή άλλων πολύ πιο ακριβών μεθόδων της ενόργανης χημικής ανάλυσης. Η εφαρμογή τους στην γρήγορη ανίχνευση τοξινών σε είδη, που καταναλώνουμε στην καθημερινή μας ζωή, είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για την δημόσια υγεία. Στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκε κατ’ αρχήν ένας πρότυπος βιοαισθητήρας ροής (flow injection με ταχύτητα 2 ml/min) για προσδιορισμό της τοξίνης της χολέρας σε υδατικά μικρο-δείγματα (10 μL ή 20 μL). Ο βιοαισθητήρας αυτός κατασκευάστηκε με εναπόθεση νανοστιβάδων γραφενίου σε φύλλα χαλκού με ενσωματωμένες λιπιδικές μεμβράνες (BLMs), που τροποποιήθηκαν με φυσικούς υποδοχείς GM1 (receptors). Στον προτεινόμενο βιοαισθητήρα έγινε έλεγχος της αναγεννησιμότητας ανά 6 λεπτά με 10 επιτυχείς αναγεννήσεις (διατήρηση της αρχικής δραστικότητάς του). Ο έλεγχος του βιοαισθητήρα σε πρότυπα δείγματα νερών λίμνης ήταν επιτυχής και δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές υπό την επίδραση 7 συνηθισμένων παρεμποδιστών που εισήχθησαν σε πρότυπα δείγματα. Το πλέον κατάλληλο περιβάλλον για να γίνουν οι μετρήσεις βρέθηκε να είναι pH=7. Ο βιοαισθητήρας ελέγχθηκε σε ένα δυναμικό εύρος της τοξίνης (10nM-10μΜ) και το όριο ανίχνευσης προσδιορίστηκε σε (LOD=1nM). Στην συνέχεια έγινε μελέτη αυτού του βιοαισθητήρα σε 10 δείγματα πραγματικού νερού λίμνης και υπολογίστηκε το ποσοστό της ανάκτηση σε δύο συγκεντρώσεις της Τοξίνης (Χαμηλή 50 nM και υψηλή 7 μM). Τα ποσοστά της ανάκτησης που βρέθηκαν είναι αποδεκτά σύμφωνα με τα κριτήρια του ICH2005 για τη καταλληλόλητα του βιοαισθητήρα για χρήση σε επαναλαμβανόμενη παρακολούθηση των υδάτων.Στη συνέχεια αναπτύχθηκαν τρεις πρότυποι απτοαισθητήρες για την ανίχνευση της Αφλατοξίνης (AFM1) στο γάλα. Ο πρώτος απτοαισθητήρας χωρίς δείκτη (Label-free) κατασκευάστηκε με επιφανειακή εναπόθεση δενδριμερούς (PAMAM-4G) σε ηλεκτρόδιο χρυσού όπου ακινητοποιήθηκε ένα αμινοτροποποιημένο DNA απταμερές (aptamer 1-receptor). Ο απτοαισθητήρας αυτός χρησιμοποιήθηκε ως ηλεκτρόδιο στην ενόργανη μέθοδο ανάλυσης της διηλεκτρικής φασματοσκοπίας (EIS). Έγινε έλεγχος σε πρότυπα δείγματα γάλακτος σε δυναμικό εύρος συγκέντρωσης της τοξίνης (15-120 ng/l) και προσδιορίστηκε το όριο ανίχνευσης της τοξίνης σε (LOD=8.47 ng/l). Επίσης έγινε έλεγχος σε πραγματικά δείγματα στο ίδιο δυναμικό εύρος με παρόμοιο όριο ανίχνευσης και ανάκτηση (recovery) σήματος μεγαλύτερη από 78%. Στη συνέχεια κατασκευάστηκε ο δεύτερος απτοαισθητήρας με επιφανειακή εναπόθεση Neutravidin/Fe-COOH και ακινητοποίηση τροποποιημένων απταμερών (aptamer 2-receptor) με βιοτίνη. O απτοαισθητήρας αυτός χρησιμοποιήθηκε ως ηλεκτρόδιο στην ενόργανη μέθοδο ανάλυσης της Διαφορικής παλμικής βολταμετρίας (DPV). Έγινε έλεγχος σε πρότυπα δείγματα γάλακτος σε δυναμικό εύρος συγκέντρωσης της τοξίνης (15-120 ng/l) και προσδιορίστηκε το όριο ανίχνευσης της τοξίνης σε (LOD=8,52 ng/l). Ο απτοαισθητήρας αυτός έχει επιπλέον το καινοτόμο στοιχείο του μικρού εργαστηριακού χρόνου κατασκευής (περίπου 3 ώρες).Τέλος κατασκευάστηκε ο τρίτος απτοαισθητήρας με ακινητοποίηση τροποποιημένου απταμερούς με κυανό του μεθυλίου (receptor) αναμεμιγμένο με μερκαπτοεξανόλη. O απτοαισθητήρας αυτός χρησιμοποιήθηκε ως ηλεκτρόδιο στην ενόργανη μέθοδο ανάλυσης της Διαφορικής παλμικής βολταμετρίας (DPV). Έγινε έλεγχος σε πρότυπα δείγματα γάλακτος σε δυναμικό εύρος συγκέντρωσης της τοξίνης (31.45-3145 ng/l) και βρέθηκε όριο ανίχνευσης της τοξίνης σε (LOD=37.7 ng/l). Ο συγκεκριμένος απτοαισθητήρας παρουσίασε μεγάλες τυπικές αποκλίσεις στις καμπύλες βαθμονόμησης και για αυτό χαρακτηρίστηκε ως αντικείμενο περαιτέρω μελέτης. Όμως το όριο ανίχνευσης είναι συγκρίσιμο με βιβλιογραφικά δεδομένα.Τα όρια ανίχνευσης (LOD) και των τριών ανωτέρω πρότυπων απτοαισθητήρων, που αναπτύχθηκαν, είναι κάτω από το επιτρεπόμενο όριο τιμών που έχουν ορίσει τόσο η ΕΕ (47 ng/l) όσο και οι ΗΠΑ (471 ng/l) και δύνανται να χαρακτηριστούν κατάλληλοι για την ανίχνευση της Αφλατοξίνης Μ1 στο γάλα.