Συμβολή στη φαρμακογνωστική αξιολόγηση του Sideritis clandestina

Abstract

The genus Sideritis (Lamiaceae) consists of more than 150 species worldwide; in Greece 16 taxa of the genus prosper. Although some studies have been performed regarding its chemical composition, there are still species that have not been adequately studied, like S. clandestina ssp. peloponnesiaca, which is an endemic taxon of Northern Peloponnese. Infusions and decoctions of its aerial parts have been consumed since antiquity mainly for the treatment of respiratory infections and gastrointestinal disorders, while recent studies indicate anxiolytic and neuroprotective effects. This thesis aimed to study the chemical composition of S. clandestina ssp. peloponnesiaca and identify compounds with inhibitory activity on acetylcholinesterase, which plays an important role in neurotransmission.In the first part of this study, the chemical composition of the essential oil was determined via GC-MS. The yield of the essential oil was low and sesquiterpenes were the dominant group. Hydrodistillation (HD) was compared with ultrasound assisted extraction (UAE) and maceration (MAC), using petroleum ether as solvent. UAE successfully provided chemoprofiling of a small amount of plant material (3g) in a short period of time, whereas MAC requires large amounts of solvent and underestimates the concentration of some groups of volatile components. Furthermore, the plant material was incubated in citrate buffer, pH 4.8, in the presence (HD-E and UAE-E) and absence (HD-A and UAE-A) of the enzymes cellulase, hemicellulase and pectinase prior to HD and UAE. HD-A and UAE-A increased the overall yield and the concentration of the volatile components. The UAE-A method is optimal for the determination of volatile components in very small amounts of plant tissue.In order to study the non-volatile compounds, the plant was extracted successively with petroleum ether, ethyl acetate and methanol. The extracts of ethyl acetate and methanol were submitted to UPLC-HRMS analysis. Eighteen compounds were detected in the methanol extract, mainly flavonoid derivatives of apigenin, hypolaetin, luteolin and isoscutellarein and fifteen compounds in the ethyl acetate extract, but only five of the latter were identified. Subsequently, the ethyl acetate extract was subjected to fractionation guided by the ability of the fractions to inhibit the enzyme acetylcholinesterase. Three diterpenoids were isolated: siderol, which has been identified in many Sideritis species and two new diterpenoids ent-19-hydroxykaur-15-en-17-carboxylic isobutyl ester, ent-19-hydroxykaur-15-en-17-carboxylic sec-butyl ester. Siderol showed the highest inhibition of AChE (45 % at the concentration of 200 μg / mL). However, the inhibition values of all three diterpenes were characterized medium to low.The infusion of S. clandestina ssp. peloponnesiaca was submitted to UHPLC-MS analysis and colorimetric assays, and it was rich in phenolics and derivatives of apigenin, hypolaetin and isoscutellarein. It exhibited high antioxidant activity, as it scavenges the DPPH˙ free radical (IC50 =0.10 ± 0.04 mg / mL /g of dry infusion), while in FRAP method the reduction capacity was equal to 2.79 ± 0.51 mmol FeSO4 g of dry infusion. However it displayed moderate inhibition of AChE.

Το γένος Sideritis (οικογένεια Lamiaceae) περιλαμβάνει πάνω από 150 είδη παγκοσμίως· στην Ελλάδα ευδοκιμούν 16 taxa. Αν και έχουν διεξαχθεί μελέτες της χημικής σύστασης ορισμένων, υπάρχουν ακόμα taxa που δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς, όπως το φυτό S. clandestina ssp. peloponnesiaca, το οποίο είναι ενδημικό της Βόρειας Πελοπόννησου. Αφεψήματα και εγχύματα των υπέργειων τμημάτων του καταναλώνονται από την αρχαιότητα κυρίως για την αντιμετώπιση λοιμώξεων του αναπνευστικού συστήματος και διαταραχών του πεπτικού συστήματος, ενώ νεότερες μελέτες υποδεικνύουν αγχολυτική και νευροπροστατευτική δράση. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση της χημικής σύστασης του S. clandestina ssp. peloponnesiaca και η απομόνωση ενώσεων με ανασταλτική δράση επί του ενζύμου της ακευλοχολινεστεράσης, το οποίο έχει σημαντικό ρόλο στη νευροδιαβίβαση.Αρχικά, προσδιορίστηκε η χημική σύσταση του αιθέριου ελαίου με GC-MS με τη μέθοδο της υδροαπόσταξης. Η απόδοση σε αιθέριο έλαιο ήταν πολύ χαμηλή και τα σεσκιτερπένια αποτελούσαν την κυρίαρχη ομάδα. Η υδροαπόσταξη (HD) συγκρίθηκε με την εκχύλιση με υπερήχους (UAE) και τη διαβροχή (MAC) με πετρελαϊκό αιθέρα. Η UAE παρείχε μία ικανοποιητική εκτίμηση της σύστασης με μικρή ποσότητα φυτικού υλικού (3 g) σε μικρό χρονικό διάστημα, ενώ η MAC απαιτεί μεγάλες ποσότητες διαλύτη και κάνει υποεκτίμηση της συγκέντρωσης κάποιων ομάδων πτητικών συστατικών. Περαιτέρω, το φυτικό υλικό επωάστηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού οξέος, pH 4,8, παρουσία (HD-Ε και UAE-Ε) και απουσία (HD-Α και UAE-Α) των ενζύμων κυτταρινάση, ημικυτταρινάση και πηκτινάση πριν τις διεργασίες HD και UAE. Οι HD-A και UAE-A ενίσχυσαν τη συνολική απόδοση και αύξησαν τη συγκέντρωση των πτητικών συστατικών. Η μέθοδος UAE-A ενδείκνυται για τον προσδιορισμό των πτητικών συστατικών σε πολύ μικρές ποσότητες φυτικού ιστού.Για τον προσδιορισμό των μη πτητικών συστατικών, έγινε διαδοχική εκχύλιση της δρόγης σε πετρελαϊκό αιθέρα, οξικό αιθυλεστέρα και μεθανόλη. Τα εκχυλίσματα του οξικού αιθυλεστέρα και της μεθανόλης υποβλήθηκαν σε UPLC-HRMS ανάλυση. Στο μεθανολικό εκχύλισμα ανιχνεύθηκαν δεκαοχτώ συστατικά, κυρίως παράγωγα των φλαβονοειδών απιγενίνη, υπολαετίνη, και ισοσκουτελλαρεΐνη. Στο εκχύλισμα του οξικού αιθυλεστέρα βρέθηκαν δεκαπέντε ενώσεις, ωστόσο μόνο πέντε εξ’ αυτών ταυτοποιήθηκαν. Στη συνέχεια, το εκχύλισμα του οξικού αιθυλεστέρα υποβλήθηκε σε κλασμάτωση καθοδηγούμενη από την ικανότητα των κλασμάτων να αναστέλλουν το ένζυμο ακετυλοχολινεστεράση. Απομονώθηκαν τρία διτερπενοειδή: η σιδερόλη, η οποία έχει ταυτοποιηθεί σε πολλά είδη του Sideritis, και δύο καινούριες ενώσεις, το ent-19-υδροξυκαουρ-15-εν-17-καρβοξυλικός ισοβουτυλεστέρας και το ent-19-υδροξυκαουρ-15-εν-17–καρβοξυλικός sec-βουτυλεστέρας, εκ των οποίων η σιδερόλη εμφάνισε την υψηλότερη αναστολή (45 % στη συγκέντρωση των 200 μg / mL). Ωστόσο, συνολικά οι αναστολές και των τριών διτερπενίων χαρακτηρίζονται μέτριες έως χαμηλές.Η ανάλυση του εγχύματος του S. clandestina ssp. peloponnesiaca με UHPLC-MS και χρωματομετρικές δοκιμές έδειξε ότι το έγχυμα ήταν πλούσιο σε φαινολικά και παράγωγα της απιγενίνης, υπολαετίνης και ισοσκουτελλαρεΐνης. Επέδειξε υψηλή αντιοξειδωτική δράση καθώς η IC50 δέσμευσης της ρίζας του DPPH ήταν 0,10 ± 0,045 mg / mL ανά g ξηρού εγχύματος, ενώ στη μέθοδο FRAP η αναγωγική ικανότητα ισοδυναμούσε με 2,79 ± 0,515 mmol FeSO4 ανά g ξηρού εγχύματος, ωστόσο η αναστολή που επέφερε το έγχυμα στην ΑChE ήταν μέτρια.