Εθνοφαρμακολογική μελέτη φυτών της ελληνικής χλωρίδας για τον εντοπισμό κυτταροτοξικών φυσικών προϊόντων και αναστολέων των ενζύμων ακετυλοχολινεστεράση, υαλουρονιδάση και φωσφολιπάση

Abstract

The contribution of the ethnopharmacological studies in the discovery of new drugs is really important, undoubted and is occurring over decades. More and more researchers show a great interest in that interdisciplinary field throughout the last years. Although the tracing of new bioactive compounds through ethnopharmacology is time-consuming and includes lots of steps and various difficulties, it can really lead to important findings such as the cases of curare, galanthamine and artemisinin.The beginning of this research was the study of two texts belonging to two Greek physicians – grammarians who lived during different chronological periods, Nicander of Colophon (2nd century BC) and Nikolaos Ieropais (17th century), and wrote two works of different type and content but both referred to the use of herbs as treatments for the reported ailments. The work of the first writer, Theriaca, is a poem consisting of 958 lyrics written in an ancient idiomatic dialect and thus difficult to translate. The translation of this was accomplished in 2014 so it became easy to use as a source of therapeutic plants. The text describes several species of venomous invertebrates (e.g. venomous snakes, spiders and scorpions) and insects, the damages caused on humans from their bites and several herbs used as remedies, fumigations, ointments and antidotes. The work of the second writer, Ieropais, is a Post-Byzantine manuscript, describing various illnesses and their phytotherapeutic treatments. From this source, only the information and the herbs related to several types of hyperplasia were recorded and evaluated. In both occasions, the exhaustive study of the texts led to the interpretation of 217 medicinal plants according to literature and late byzantine glossaries and two lists of the reported plant species with anticancer and anti-venom prorerties, respectively, were developed. The two lists had a number of species in common. The use of the suitable glossaries permitted the correspondence of these herbs with their contemporary latin names. Moreover there was made a selection of 31 plant species which were collected during the years 2015-2016.Furthermore the most appropriate experimental procedure was designed in order to reveal the accuracy of the two scripts and lead to bioactive secondary metabolites. The pharmacological targets of this ethnopharmacological research were on the one hand three different types of hydrolytic enzymes, acetylcholinesterase, hyaluronidase and phospholipase which are involved in snake envenomation as they induce the local effect and help the spreading of the toxins into the system and are related to Theriaca, and on the other hand three cancer cell lines, breast adenocarcinoma (MCF-7), melanoma (A2058), hepatocellular carcinoma (HepG2) and a normal cell line, CCD-25Sk, of fibroblasts which are related to the text of Ieropais. The collected plant species were extracted with solvents of diefferent polarities i.e. dichloromethane, alcohol and alcohol/water 50/50. The obtained extracts along with some others from our in-house library constituted a new ‘ethnopharmacological’ library of extracts. Their chemical profiling was accomplished through High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC) and Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (LC - MS). The in vitro biological evaluation of the crude extracts in the aforementioned targets was the next step. Seven extracts were selected for further phytochemical analysis because of their interesting chemical content, their endemism and their significant biological activities (inhibitory capacities). Aristolochia hirta exhibits a great interest since it is an endemic species of the region of East Aegean islands and Turkey, there is no previous phytochemical study and contains metabolites which belong to the category of aristolochic acid. Also the hydroalcoholic extract of the aerial parts showed strong inhibition of AChE. The two hydroalcoholic extracts from the roots (AHRC) and aerial parts (AHYC) of the species Aristolochia hirta (Aristolochiaceae) were fractionated by means of FCPC. Seven major compounds were isolated from the obtained fractions of the root’s extract. They belong to aristolochic acids and coumaroyl-derivatives. The initial extract (AHRC) and its fractions did not exhibit noteworthy inhibition of phospholipase. In the case of the fractions of the aerial part’s extract (AHYC), the HetCA technique was performed, after their biological evaluation regarding their ability of acetylcholinesterase inhibition and the recording of their 1H – NMR spectra. As a result HetCA designated caffeoylmalic acid as the most potent acetylcholinesterase inhibitor. Caffeoylmalic acid was isolated, identified and exhibited strong inhibition of AChE. Its methylester derivatives and the methylesters of coumaroylmalic acid were shown to attribute also in the initial inhibitory activity, through the HetCA approach. The methanolic extract of the roots of the species of Anchusa undulata ssp. hybrida (Boraginaceae) showed strong acetylcholinesterase inhibition and interesting chemical profile. Its FCPC fractionation was performed and the obtained fractions were evaluated for their acetylcholinesterase inhibitory capacity. The fractions which exhibited the strongest inhibitions were revealed and the responsible bioactive compound was isolated and identified as prenylhydroquinone, which was isolated for the first time in genus Anchusa. This compound strongly inhibited AChE in both methods of AChE inhibition assays. Moreover five other compounds were received such as rosmarinic acid and evaluated for their inhibitory activities. Rosmarinic acid exhibited strong AChE inhibition through NA-FBB assay and hyaluronidase inhibition. The hydroalcoholic extract of the aerial parts of the species Teucrium divaricatum ssp. divaricatum (Lamiaceae) exhibited important cytotoxic activity against MCF-7 cell line and acetylcholinesterase inhibitory activity, with the method of NA-FBB. Its chemical content was also interesting. Its fractionation was performed through FCPC. The biological assessment regarding the acetylcholinesterase and hyaluronidase inhibition for all the obtained fractions was performed. Ten major compounds were isolated after chromatographic separations. These compounds belong to several chemical categories such as phenolics (e.g. chlorogenic acid), phenylpropanoids (e.g. teucrioside) and glucosylated flavonoids (e.g. isoquercetin). The iridoid 8-Ο-(3,4-dimethoxycinammoyl) myoporoside was isolated for the first time. The phenylpropanoids exhibited the highest percentages of AChE inhibition (NA-FBB assay). Teucrioside was the strongest inhibitor. The hydroalcoholic extract of the aerial parts of Adiantum capillus-veneris (Pteridaceae) showed moderate cytotoxic and anti-acetylcholinesterase, anti-hyaluronidase activities while its chemical profile was the main reason of its selection for further phytochemical analysis. The crude extract was fractionated through FCPC and the obtained fractions were evaluated as possible acetylcholinesterase and hyaluronidase inhibitors. Six secondary metabolites, which mainly belong to the chemical categories of chlorogenic acids and flavonoid glucuronides were isolated. Only some mixtures of the obtained hydrolysable tannins showed noticeable anti-AChE activity. The two hydroalcoholic extracts obtained from the roots and aerial parts of the the greek endemic species Paeonia parnassica (Paeoniaceae) exhibited important cytotoxic activities and abilities to inhibit acetylcholinesterase and hyaluronidase. It is important to mention that there was no other research for the secondary metabolites of the aerial parts while there were only two previous reports for the roots. These extracts were fractionated through Centrifugal Partition Chromatography (FCPC). The biological evaluation of the obtained fractions regarding their hydrolases inhibitory capacities was followed. Also their 1H – NMR spectra were recorded. A recently developed bioactivity-guided-NMR dereplication method, HeteroCovariance Approach (HetCA), which permits the correlation of NMR and biological data, was performed in order to detect the responsible bioactive compounds of the fractions, prior to any isolation. The revelation of the compounds from the roots and aerial parts extracts which mostly contributed to the observed inhibitory activities was feasible thanks to HetCA. Afterwards a number of targeted purifications of secondary metabolites and their consequent measurements of bioactivity took place so that we could find out the accuracy of the HetCA results. Thirteen compounds from the roots extract (paeoniflorigenone, methyl gallate, paeonilactone B, paeoniflorin, oxypaeoniflorin, albiflorin) and nineteen compounds from the aerial parts extract (4 compounds in common) were received and their chemical structures were identified by means of NMR. The biological evaluation of the secondary metabolites showed that 1,2,3,4,6-pentagalloyl-glucose was the most potent inhibitor while components like gallic acid were moderate inhibitors. To summarize two medicinal texts were studied and their respective lists of the reported plant species were created. Some of the plants were collected and extracted with different solvents. Seven crude extracts were assessed phytochemically and biologically. They were fractionated and 58 secondary metabolites were obtained. The compounds belong to several chemical categories like iridoids, phenolics, flavonoids, phenylpropanoids, aristolochic acids etc The diversity of the obtained compounds was initially a target of this research. Then the metabolites were tested as acetylcholinesterase and hyaluronidase inhibitors. Some of them like prenylhydroquinone, teucrioside were strong AChE inhibitors and others were strong hyaluronidase inhibitors like rosmarinic acid. In the end it was possible to rationalize the use of the initial herbs as antidotes and anticancer therapies and introduce the exploitation of them for the handling of contemporary diseases. Finally it was important that the statistical tool HetCA was used for the study of three of the extracts in order to examine if it can consist a new, quicker, scientific approach and assessment of the ethnopharmacological data.

Η προσφορά των εθνοφαρμακολογικών μελετών στην ανακάλυψη νέων φαρμάκων είναι σημαντική, αδιαμφισβήτητη και πολυετής. Τα τελευταία χρόνια ολοένα και περισσότεροι είναι οι επιστήμονες που στρέφονται προς αυτό το διεπιστημονικό πεδίο έρευνας το οποίο παρότι είναι χρονοβόρο και παρουσιάζει ποικίλες δυσκολίες μπορεί να οδηγήσει σε σπουδαία ευρήματα όπως συναίβει στις περιπτώσεις του κουραρίου, της γαλανθαμίνης και της αρτεμισινίνης.Αφετηρία της παρούσας εργασίας αποτέλεσαν δύο κείμενα Ελλήνων θεραπευτών - λόγιων οι οποίοι έζησαν σε διαφορετικές χρονικές περιόδους, Νίκανδρος ο Κολοφώνιος (2ος αιώνας π.Χ.) και Νικόλαος Ιερόπαις (17ος αιώνας μ.Χ.), και συνέταξαν δύο διαφορετικού τύπου και περιεχομένου έργα με κοινό όμως χαρακτηριστικό τη χρήση των βοτάνων για τη θεραπεία των ασθενειών που πραγματεύονται. Το έργο του πρώτου συγγραφέα, Θηριακά, είναι ένα ποίημα αποτελούμενο από 958 στίχους, γραμμένο σε ομηρίζουσα διάλεκτο και με αρκετά δυσνόητο περιεχόμενο, το οποίο μεταφράστηκε στη νέα ελληνική γλώσσα το 2014 οπότε και έγινε δυνατή η χρησιμοποίησή του ως εθνοφαρμακολογική πηγή. Αποτελεί ένα κείμενο όπου περιγράφονται διάφορα είδη ιοβόλων ερπετών και εντόμων, οι επιπτώσεις που προκαλούνται στον άνθρωπο όταν προσβληθεί από αυτά καθώς και μια πληθώρα βοτάνων, υπό τη μορφή συνταγών, που χορηγούνται είτε per os είτε τοπικά, ικανών να λειτουργήσουν ως αντίδοτα και θεραπείες αυτών των καταστάσεων. Το έργο του Ιερόπαιδα είναι ένα χειρόγραφο μεταβυζαντινής περιόδου στο οποίο περιγράφονται οι ασθένειες και οι αντίστοιχες συνταγές φυτοθεραπευτικής. Από αυτό καταγράφηκαν και αξιοποιήθηκαν μόνο οι πληροφορίες που αφορούσαν φυτικές δρόγες ενάντια υπερπλασιών. Και στις δύο περιπτώσεις, η εξαντλητική μελέτη των κειμένων οδήγησε στην καταγραφή 217 φυτικών ειδών, κάποια από τα οποία είναι κοινά, ενώ καταρτίστηκαν δύο λίστες με τα φυτικά είδη που περιγράφονται στα έργα αυτά με αντιοφικές και αντικαρκινικές ιδιότητες, αντίστοιχα. Για κάθε φυτικό είδος έγινε χρήση κατάλληλων εγχειριδίων, βιβλιογραφίας και λεξικών, προκειμένου να επιτευχθεί μια εύστοχη αντιστοίχιση του αναφερόμενου βοτάνου με τη σύγχρονη λατινική του ονομασία. Ακολούθως πραγματοποιήθηκε επιλογή 31 φυτικών ειδών τα οποία συλλέχθηκαν κατά τα έτη 2015-2016. Εν συνεχεία ορίστηκε η καταλληλότερη πειραματική πορεία η οποία θα μπορούσε να αποδείξει την αιτιολογική βάση των υπό μελέτη κειμένων και να οδηγήσει σε βιοδραστικά φυσικά προϊόντα. Οι φαρμακολογικοί στόχοι που πλαισίωσαν την συγκεκριμένη εθνοφαρμακολογική μελέτη είναι τρία διαφορετικά υδρολυτικά ένζυμα, η ακετυλοχολινεστεράση, η υαλουρονιδάση, η φωσφολιπάση τα οποία απαντώνται στο δηλητήριο των οφιοειδών και σχετίζονται με τα Θηριακά και τρεις καρκινικές κυτταρικές σειρές, στήθους (MCF-7), μελανώματος (A2058) και ηπατοκαρκινώματος (HepG2) και μια φυσιολογική σειρά ινοβλαστών CCD-25Sk, οι οποίες σχετίζονται με το κείμενο του Ιερόπαιδα. Τα συλλεχθέντα φυτικά είδη εκχυλίστηκαν με διαλύτες διαφορετικής πολικότητας, διχλωρομεθάνιο, αλκοόλη, αλκοόλη/νερό 50/50. Τα παραληφθέντα εκχυλίσματα μαζί με κάποια ακόμη που προϋπήρχαν στο εργαστήριο αποτέλεσαν μια ‘εθνοφαρμακολογική’ βιβλιοθήκη εκχυλισμάτων. Ο έλεγχος του χημικού φορτίου αυτών έγινε με Χρωματογραφία Λεπτής Στοιβάδας Υψηλής Απόδοσης (HPTLC) και με Υγρή Χρωματογραφία – Φασματομετρία Μάζας (LC - MS). Ακολούθησε ο in vitro βιολογικός έλεγχος των ολικών εκχυλισμάτων στους στόχους που αναφέρθηκαν παραπάνω. Επτά εκχυλίσματα επελέγησαν να αναλυθούν φυτοχημικά καθώς παρουσίασαν ενδιαφέρον τόσο ως προς το χημικό τους φορτίο όσο και ως προς τη δράση του επέδειξαν. Το είδος Aristolochia hirta παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθώς αποτελεί ενδημικό είδος των νήσων Ανατολικού Αιγαίου και Μικράς Ασίας, δεν υπάρχει προηγούμενη μελέτη που να αφορά τη φυτοχημεία των ριζών και των υπέργειων τμημάτων και περιέχει δευτερογείς μεταβολίτες που ανήκουν στην κατηγορία των αριστολοχικών οξέων. Επίσης το υδατομεθανολικό εκχύλισμα των υπέργειων τμημάτων του είδους εμφάνισε ισχυρή ανασταλτική δράση ενάντια της AChE. Τα δύο υδατομεθανολικά εκχυλίσματα των ριζών (AHRC) και των υπέργειων τμημάτων (AHYC) του είδους Aristolochia hirta (Aristolochiaceae) κλασματώθηκαν με Φυγόκεντρο Χρωματογραφία Κατανομής (FCPC). Η επεξεργασία ορισμένων κλασμάτων του εκχυλίσματος των ριζών οδήγησε στο χρωματογραφικό διαχωρισμό και την απομόνωση των 7 κυριότερων δευτερογενών μεταβολιτών οι οποίοι ανήκουν στις κατηγορίες των αριστολοχικών όπως τα αριστολοχικό οξύ I, II και IV και των κουμαρικών οξέων όπως, 6-O-π-κουμαροϋλο-α-D-γλυκοπυρανόση και 6-O-π-κουμαροϋλο-β-D-γλυκοπυρανόση. Το εκχύλισμα AHRC και τα CPC κλάσματά του δεν εμφάνισαν αξιοσημείωτη βιολογική δράση στη δοκιμασία αναστολής της φωσφολιπάσης. Στην περίπτωση των κλασμάτων που προήλθαν από το υδατομεθανολικό εκχύλισμα των υπέργειων τμημάτων του είδους έγινε αξιολόγηση της ικανότητας αναστολής της ακετυλοχολινεστεράσης ενώ πραγματοποιήθηκε η λήψη των φασμάτων 1H – NMR. Ο υπεύθυνος για τη δράση μεταβολίτης απομονώθηκε και ταυτοποιήθηκε ως το καφεοϋλομαλικό οξύ ενώ υπολογίστηκε η μέση ανασταλτική συγκέντρωση του στη δοκιμασία ανστολής της AChE με τη μέθοδο NA-FBB. Μέσω της μεθόδου ετεροσυνδιακύμανσης (HetCA) ήταν δυνατή η επαλήθευση της υπεύθυνης, για την παρατηρούμενη ισχυρή δράση, ουσίας. Επίσης αναδείχθηκε η συμβολή στη δράση και των μεθυλεστέρων του trans-καφεοϋλομαλικού οξέος και του trans-κουμαροϋλομαλικού οξέος. Το μεθανολικό εκχύλισμα των ριζών του είδους Anchusa undulata ssp. hybrida παρουσίασε ισχυρή αναστολή της ακετυλοχολινεστεράσης και ενδιαφέρον χημικό προφίλ. Κλασματώθηκε με Φυγόκεντρο Χρωματογραφία Κατανομής (FCPC) και τα παραληφθέντα κλάσματα αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητα αναστολής της ακετυλοχολινεστεράσης. H ισχυρότερη δράση εντοπίστηκε σε συγκεκριμένα κλάσματα. Ακολούθησε η απομόνωση του υπεύθυνου βιοδραστικού προϊόντος το οποίο ταυτοποιήθηκε ως η πρενυλοϋδροκινόνη, η οποία απομονώθηκε πρώτη φορά από το γένος Anchusa. Η ουσία παρουσίασε ισχυρή δράση ενάντι της AChE και με τις δύο μεθόδους αξιολόγησης. Επίσης απομονώθηκαν άλλες πέντε ουσίες όπως το ροσμαρινικό οξύ και αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητα αναστολής της υαλουρονιδάσης και ακετυλοχολινεστεράσης. Το ροσμαρινικό οξύ εμφάνισε σημαντική δράση στη δοκιμασία αναστολής της AChE με τη μέθοδο NA-FBB και στη δοκιμασία αναστολής της υαλουρονιδάσης. Το υδατομεθανολικό εκχύλισμα των υπέργειων τμημάτων του είδους Teucrium divaricatum ssp. divaricatum παρουσίασε αξιοσημείωτη κυττατοτοξική δράση έναντι των MCF-7 κυττάρων και ανασταλτική της ακετυλοχολινεστεράσης δράση με τη μέθοδο NA-FBB. Επίσης εμφάνισε ενδιαφέρον χημικό φορτίο. Για τους λόγους αυτούς πραγματοποιήθηκε η κλασμάτωση του με Φυγόκεντρο Χρωματογραφία Κατανομής (FCPC). Τα κλάσματα αυτού αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητα αναστολής της ακετυλοχολινεστεράσης και υαλουρονιδάσης. Μέσω χρωματογραφικών τεχνικών έγινε δυνατή η απομόνωση δέκα δευτερογενών μεταβολιτών οι οποίοι ανήκουν στις κατηγορίες των φαινολικών όπως το χλωρογενικό οξύ, των φαινυλοπροπανοειδών όπως ο τεουκριοσίδης αλλά και των γλυκοζυλιωμένων φλαβονοειδών όπως η ισοκερκετίνη. Επίσης παραλήφθηκε το ιριδοειδές 8-Ο-(3,4-διμεθοξυκινναμοϋλο)μυοποροσίδης, για τον οποίο δεν υπάρχει προηγούμενη αναφορά. Στον έλεγχο της βιολογικής δράσης, ισχυρή αναστολή της AChE με τη μέθοδο NA-FBB προκάλεσαν τα φαινυλοπροπανοειδή, με ισχυρότερη τη δράση του τεουκριοσίδη. Το υδατομεθανολικό εκχύλισμα των υπέργειων τμημάτων του είδους Adiantum capillus-veneris παρουσίασε μέτρια δράση στις δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας (μόνο το άπολο εκχύλισμα ήταν δραστικό έναντι των MCF-7 κυττάρων) και αναστολής της ακετυλοχολινεστεράσης και υαλουρονιδάσης. Ωστόσο οι εθνοφαρμακολογικές αναφορές και το χημικό του προφίλ αποτέλεσαν τις βασικότερες αιτίες για την περαιτέρω φυτοχημική του ανάλυση. Το εκχύλισμα κλασματώθηκε με Φυγόκεντρο Χρωματογραφία Κατανομής (FCPC) και τα κλάσματά του αξιολογήθηκαν ως πιθανοί αναστολείς της ακετυλοχολινεστεράσης και υαλουρονιδάσης. Ακολούθησε η απομόνωση έξι δευτερογενών μεταβολιτών με χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού. Οι καθαρές ουσίες δοκιμάστηκαν στα ένζυμα – στόχους όπου μόνο τα μίγματα των υδρολυόμενων ταννινών εμφάνισαν σημαντική δράση ενάντια στην AChE, και με τις δύο μεθόδους αξιολόγησης. Τα δύο υδατομεθανολικά εκχυλίσματα των ριζών και των υπέργειων τμημάτων του ελληνικού ενδημικού είδους Paeonia parnassica (Paeoniaceae) παρουσίασαν σημαντική κυτταροτοξική δράση και αναστολή της ακετυλοχολινεστεράσης και υαλουρονιδάσης. Η έλλειψη προηγούμενων αναφορών για τους δευτερογενείς μεταβολίτες των υπέργειων τμημάτων τους είδους και η ύπαρξη μόνο δύο για τις ρίζες αποτέλεσαν επιπλέον λόγους επιλογής του είδους προς περαιτέρω μελέτη. Τα εκχυλίσματα αυτά κλασματώθηκαν με Φυγόκεντρο Χρωματογραφία Κατανομής (FCPC). Ακολούθησαν η βιολογική αξιολόγηση των κλασμάτων ενάντια των υδρολυτικών ενζύμων και η παραλαβή των φασμάτων 1H - NMR. Για τον εντοπισμό των υπεύθυνων βιοδραστικών φυσικών προϊόντων στα κλάσματα, πριν πραγματοποιηθεί η απομόνωσή τους, εφαρμόσθηκε μια πρόσφατα ανεπτυγμένη μέθοδος ετεροσυνδιακύμανσης (Heterocovariance, HetCA) η οποία επιτρέπει το συσχετισμό δεδομένων NMR και βιολογικής δραστικότητας. Μέσω της μεθόδου HetCA έγινε δυνατή η ανίχνευση των ουσιών που προέρχονταν από το υδατομεθανολικό εκχύλισμα είτε των ριζών είτε των υπέργειων τμημάτων και οι οποίες συνεισέφεραν περισσότερο στις παρατηρούμενες δράσεις. Εν συνεχεία, προκειμένου να διαπιστωθεί η ακρίβεια των αποτελεσμάτων HetCA για τους δευτερογενείς μεταβολίτες που συνεισφέρουν ή όχι στη δράση, ακολούθησε στοχευμένη απομόνωση των ουσιών από τα κλάσματα που ανιχνεύθηκαν και αξιολόγηση της δραστικότητάς τους. Έτσι έγινε δυνατή η παραλαβή 13 ουσιών (παιωνιφλοριγενόνη, γαλλικός μεθυλεστέρας, παιωνιλακτόνη Β, παιωνιφλορίνη, οξυπαιωνιφλορίνη, αλμπιφλορίνη,) από το εκχύλισμα των ριζών και 19 ουσιών (4 κοινές ουσίες) από το εκχύλισμα των υπέργειων τμημάτων και η ταυτοποίησή τους πραγματοποιήθηκε με πειράματα NMR. Μέσω της βιολογικής αξιολόγησης αυτών αναδείχθηκε η ουσία 1,2,3,4,6 – πενταγαλλικός εστέρας της γλυκόζης ως ο πιο δραστικός μεταβολίτης ενώ ουσίες όπως το γαλλικό οξύ ως μέτριας δραστικότητας έναντι των ενζυμικών στόχων. Συμπερασματικά, δύο κείμενα θεραπευτικής μελετήθηκαν και από αυτά δημιουργήθηκαν λίστες των αναφερόμενων φυτικών ειδών. Πραγματοποιήθηκε η συλλογή ορισμένων από αυτά και η εκχύλιση τους με διαλύτες διαφορετικών πολικοτήτων. Επτά εκχυλίσματα αξιολογήθηκαν περαιτέρω και επεξεργάστηκαν φυτοχημικά και φαρμακολογικά. Εν συνεχεία κλασματώθηκαν και από αυτά απομονώθηκαν 58 ουσίες, μετά από κατεργασία. Οι ουσίες ανήκουν σε ποικίλες χημικές κατηγορίες, όπως ιριδοειδή, μονοτερπένια, φαινολικά, φλαβονοειδή, αριστολοχικά οξέα κ.ά. Η ποικιλία των δευτερογενών μεταβολιτών ήταν εξ’αρχής στόχος της παρούσας μελέτης. Οι ουσίες αξιολογήθηκαν φαρμακολογικά στις δοκιμασίες αναστολής της ακετυλοχολινεστεράσης και υαλουρονιδάσης. Κάποιες από αυτές ήταν πολύ δραστικές στον πρώτο ενζυμικό στόχο π.χ. τεουκριοσίδης, πρενυλοϋδροκινόνη και άλλες στο δεύτερο ενζυμικό στόχο π.χ. ροσμαρινικό οξύ. Η παραλαβή δραστικών μεταβολιτών θα μπορούσε να υποστηρίξει την εθνοφαρμακολογική χρήση των φυτικών ειδών από τα οποία προήλθαν. Τέλος σημαντικό είναι ότι χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό εργαλείο HetCA, το οποίο επιτρέπει τη συσχέτιση βιολογικής δράσης και φασματοσκοπικών δεδομένων, ως ένας νέος, πιο σύντομος, τρόπος διαχείρισης και αξιολόγησης του μεγάλου όγκου των εθνοφαρμακολογικών δεδομένων.