Ανάλυση ψυχοτρόπων ουσιών και φαρμάκων σε μη συμβατικά βιολογικά υλικά και μελέτη της σταθερότητας αυτών σε μονιμοποιημένους ιστούς

Abstract

In the present PhD thesis, a liquid chromatography method combined with mass spectrometry (LC-MS/MS) was developed for the simultaneous determination of 84 compounds from different classes such as opiates, amphetamines, cocaine, cannabinoids, antidepressants, antipsychotics, benzodiazepines, barbiturates, hypnotics, antiepileptics and new designer drugs. Thereafter a method for human bones was developed and forensic samples (fresh and one year after burial) from chronic drug abusers, were analyzed. Finally, opiates, cocaine and its metabolites, benzodiazepines, antipsychotics and antidepressants were detected. The conclusion was that substances of different categories can be detected in human bones up to one year after death. A reliable post-mortem blood pretreatment protocol was also developed. Samples from chronic drug abusers were then analyzed. Thirty different substances were detected and quantified, most of them opiates and benzodiazepines. Finally, both opiates and drugs were detected, as could be expected in heroin abusers. The next step was to develop a method for liver tissue. Liver samples from the same drug abusers were analyzed and the results were cross-evaluated between liver and blood. 67% of the substances were found in both liver and blood, while some compounds were detected only in liver. 6-mono-acetyl-morphine was not detected in any sample, although other substances that indicate heroin abuse (morphine, codeine, etc.) were found. Finally another aim of the study was to investigate fixed liver tissues. This was done by analyzing fresh tissue and one, three, six and twelve months after fixation. At the same time, a pretreatment protocol for formalin solution has been developed in order to investigate the potential for diffusion of the substances into this solution. From the evaluation of the liver-formalin results it was observed that it is extremely difficult to detect opiates in fixed liver tissue, apart from papaverine, which was detected up to one year after the fixation. Methadone may also be detected for up to one year. Benzodiazepines proved to be particularly stable because they can be detected up to twelve months. Finally, it is concluded that fixed liver tissues can be used as biological materials for toxicological analysis, because a large number of substances can be detected for up to one year. All, the developed methods for bone, blood, liver and formaline were validated by evaluating the following analytical parameters: accuracy, repeatability, linearity, matrix effect and recovery, while stability, selectivity, sensitivity, limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were determined. During the development of the above methods (bone-blood-liver-formalin) the most efficient QuEChERS protocol was chosen among the different tested, and this was applied to all blood and liver samples. This suggests a novelty of the thesis as QuEChERS has not yet been reported so far in the literature for the determination of such a large number of substances.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αρχικά πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη μεθόδου υγρής χρωματογραφίας σε συνδυασμό με φασματομετρία μαζών σε σειρά (LC-MS/ΜS) για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό 84 ενώσεων που ανήκουν στις ομάδες των οπιούχων, αμφεταμινών, αλκαλοειδών της κόκας, κανναβινοειδών, αντικαταθλιπτικών, αντιψυχωσικών, βενζοδιαζεπινών, βαρβιτουρικών, υπνωτικών, αντιεπιληπτικών αλλά και νέων ναρκωτικών. Έπειτα, αναπτύχθηκε μέθοδος προκατεργασίας ανθρώπινων οστών και αναλύθηκαν (νωπά και μετά από ένα χρόνο ταφής) μεταθανάτια δείγματα χρόνιων χρηστών ναρκωτικών ουσιών. Τελικά, ανιχνεύθηκαν οπιούχα, αλκαλοειδή της κόκας, βενζοδιαζεπίνες, αντιψυχωσικά και αντικαταθλιπτικά κάτι που σημαίνει ότι όχι μόνο είναι εφικτή η ανίχνευση ουσιών διαφορετικών κατηγοριών στα ανθρώπινα οστά, αλλά επιπλέον ότι ανιχνεύονται μέχρι και ένα χρόνο μετά τον θάνατο. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκε μέθοδος προκατεργασίας ολικού μεταθανάτιου αίματος και αναλύθηκαν δείγματα χρόνιων χρηστών ναρκωτικών ουσιών. Ποσοτικοποιήθηκαν τριάντα διαφορετικές ουσίες, κυρίως οπιούχα και βενζοδιαζεπίνες, ενώ παρατηρήθηκε ταυτόχρονη λήψη οπιούχων και φαρμάκων, αναμενόμενο με βάση το ιστορικό των περιστατικών χρήσης ηρωίνης. Επόμενο βήμα ήταν η ανάπτυξη μεθόδου προκατεργασίας ιστοτεμαχίων ανθρώπινου ήπατος και αναλύθηκαν δείγματα των ίδιων περιστατικών με αυτά του αίματος. Παρατηρήθηκε ότι το 67% των ουσιών βρέθηκε και στα δύο υποστρώματα, ενώ ορισμένες ουσίες ήταν παρούσες μόνο στο ήπαρ. Δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα δείγμα η 6-μονο-ακέτυλο-μορφίνη, αν και βρέθηκαν άλλες ουσίες όπως η μορφίνη, η κωδεΐνη κ.α. που υποδηλώνουν χρήση ηρωίνης. Τελευταίος στόχος ήταν η μελέτη της σταθερότητας ουσιών σε μονιμοποιημένους ιστούς ήπατος. Αναλύθηκε νωπός ιστός και εν συνεχεία έπειτα από ένα, τρείς, έξι και δώδεκα μήνες μονιμοποίησης. Παράλληλα, αναπτύχθηκε πρωτόκολλο προκατεργασίας της φορμόλης προκειμένου να εξεταστεί το ενδεχόμενο διάχυσης των ουσιών στο διάλυμα αυτό. Από την μελέτη των αποτελεσμάτων ήπατος-φορμόλης παρατηρήθηκε πως είναι εξαιρετικά δύσκολο να ανιχνευθεί κάποιο οπιούχο σε μονιμοποιημένο ιστό ήπατος, παρά μόνο η παπαβερίνη, η οποία ανιχνεύθηκε μέχρι και ένα χρόνο μετά τη μονιμοποίηση. Αντιθέτως, η λήψη μεθαδόνης μπορεί να επιβεβαιωθεί μέχρι και ένα χρόνο μετά. Οι βενζοδιαζεπίνες αποδείχθηκαν ιδιαίτερα σταθερές, διότι κατά κύριο λόγο δύναται να είναι ανιχνεύσιμες μέχρι και για δώδεκα μήνες. Τελικά, συμπεραίνεται ότι μπορούν να χρησιμοποιηθούν μονιμοποιημένοι ιστοί ήπατος ως βιολογικά υλικά για τοξικολογική εξέταση, διότι μέχρι και για ένα χρόνο μπορεί να ανιχνευθεί ένας μεγάλος αριθμός ουσιών. Κατά την ανάπτυξη των παραπάνω μεθόδων (οστό-αίμα-ήπαρ-φορμόλη) δοκιμάστηκαν διαφορετικά πρωτόκολλα προκατεργασίας, επιλέχθηκε το αποδοτικότερο και με αυτό αναλύθηκαν όλα τα δείγματα της διατριβής. Εφαρμόσθηκε μια σύγχρονη τεχνική εκχύλισης και καθαρισμού (QuEChERS) στην προκατεργασία του αίματος και του ήπατος, γεγονός που αποτελεί καινοτομία, διότι βιβλιογραφικά δεν έχει υπάρξει αναφορά χρήσης πρωτοκόλλου QuEChERS για τέτοιο μεγάλο αριθμό ουσιών. Επίσης, οι αναπτυχθείσες μέθοδοι αναφορικά με τα οστά, το αίμα, το ήπαρ και τη φορμόλη επικυρώθηκαν με αξιολόγηση των ακολούθων αναλυτικών παραμέτρων: ακρίβεια, επαναληψιμότητα, γραμμικότητα, επίδραση υποστρώματος και ανάκτηση, ενώ προσδιορίστηκαν η σταθερότητα, η εκλεκτικότητα, η ευαισθησία καθώς επίσης και τα όρια ανίχνευσης (LOD) και ποσοτικοποίησης (LOQ).