Crocus sativus L. – derived bioactive compounds: development and holistic evaluation of their biological role in neurodegenerative diseases

Abstract

Crocus sativus is a species of flowering plant of the Crocus genus in the Iridaceae family. Saffron, the dried stigmas of the flower Crocus sativus L. is considered to be among the most expensive spices in the world, and it is mainly used as a traditional herbal medicine but also as a flavoring and food coloring agent in everyday life. The main saffron constituents include crocins, which are mono- and bis-esters of crocetin with glucose and/or gentiobiose. Saffron is considered to be a potential weapon against neurodegenerative diseases since saffron, crocin, crocetin and saffranal have shown remarkable anti oxidant activity. Moreover, saffron has exhibited significant activity against Parkinson’s and Alzheimer’s disease. The overview of the current study was to isolate the most abundant crocin, trans-crocin-4 (TC4) from Cr. Sativus in sufficient quantities in order to perform a Pharmacokinetic study in mice and subsequently assess the bioavailability of TC4, in mice plasma after i.p. administration, as well as its capability to cross the Blood Brain Barrier (BBB). The final goal of this study was to explore the alterations to the metabolic fingerprint after the i.p. administration of TC4 and to annotate the features that were significantly altered. Initially, this study demonstrates a simple and effective method for one-step isolation of the main secondary metabolites of a Methanol-Water 50:50 v/v saffron extract employing step-gradient centrifugal partition chromatography (CPC) performed both in dual mode and elution−extrusion mode, using five biphasic solvent systems. In total, from all the CPC experiments performed, 6185 mg of pure TC4 were isolated, 15 saffron constituents have been isolated and characterized leading to the establishment of the developed CPC methodology, as a suitable approach for the saffron stigmas analysis in the laboratory as well as the natural products industry. The subsequent step of the current study included the development and full validation of two UPLC-PDA methodologies, according to U.S FDA and EMA guidelines, for the rapid and accurate quantification of TC4 and crocetin (CRC) in mice plasma and brain after i.p. administration. The two UPLC-PDA methods were successfully applied for the determination of CRC and TC4 in mouse plasma and brain after i.p. administration of TC4 (50 and 150 mg/kg) in a time range of 0-240 minutes. Due to the selection of i.p. administration route, the first-pass metabolism and/or gastric hydrolysis were bypassed, a fact that enhanced the bioavailability of TC4. Furthermore, TC4 was found to be capable of crossing the Blood Brain Barrier (BBB) and build up levels in the mouse brain, regardless of its highly hydrophilic character. Interestingly, CRC was not detected in any plasma or brain sample, although it has been reported that TC4 quickly hydrolyzes to CRC after p.o. administration. Therefore i.p. administration could be used in the case of TC4 for the accurate determination of its biological role. In the last step of the current study, the metabolic fingerprint and its associated alterations following i.p. administration of TC4 in male and female mice were determined by an untargeted UPLC-HRMS metabolomics approach. Statistical evaluation of the results was achieved by multivariate analysis (MVA), i.e., Principal Component Analysis (PCA), and (sparse) Partial Least Squares–Discriminant Analysis (sPLS-DA). Due to the high variability imposed by various factors e.g. sex, administration dose, and time points, the ML-(s)PLS–DA has proven to be the only effective approach. Furthermore, a preliminary sex-related effect on the metabolome has been proven to exist, denoting that the administration in both genders is indispensable in order to acquire safe conclusions as reliable metabolome pictures. Finally, this UPLC-HRMS-based methodology clearly demonstrated that the time sequence of metabolome changes was due to the administration of TC4. In accordance with the results provided by various statistical softwares, the selected features were further implemented to online databases so as to annotate them and to identify potential metabolites.

Το φυτό Crocus sativus (Κρόκος Κοζάνης) είναι ένα ανθοφόρο είδος του γένους Crocus που ανήκει στην οικογένεια Iridaceae. Το σαφράν είναι τα αποξηραμένα στίγματα του φυτού Crocus sativus L. και συγκαταλέγεται ανάμεσα στα πιο ακριβά μπαχαρικά του κόσμου. Κυρίως χρησιμοποιείται σαν φάρμακο της παραδοσιακής ιατρικής καθώς και ως αρωματικό και χρωστική τροφίμων στην καθημερινή ζωή. Στα κυριότερα συστατικά του σαφράν περιλαμβάνονται οι κροκίνες, οι οποίες είναι μονο- και δις-εστέρες κροκετίνης με γλυκόζη ή/και γεντιοβιόζη. Το σαφράν θεωρείται δυνητικό όπλο ενάντια στις νευροεκφυλιστικές ασθένειες αφού οι ουσίες που περιέχει (κροκίνη, κροκετίνη και σαφρανάλη) έχουν δείξει αξιοσημείωτη αντιοξειδωτική δράση. Επιπλέον, ο κρόκος έχει παρουσιάσει σημαντική δραστικότητα έναντι της νόσου του Πάρκινσον και του Αλτσχάιμερ. Ο κεντρικός σχεδιασμός της τρέχουσας μελέτης ήταν η απομόνωση από τον κρόκο της πιο άφθονης κροκίνης, trans-crocin-4 (TC4) σε επαρκείς ποσότητες προκειμένου να πραγματοποιηθεί μια Φαρμακοκινητική μελέτη σε ποντίκια και στη συνέχεια να εκτιμηθεί η βιοδιαθεσιμότητα της TC4, σε πλάσμα ποντικών μετά από ενδοπεριτοναϊκή (i.p.) χορήγηση καθώς και η ικανότητά της να διασχίσει τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό (ΑΕΦ). Ο τελικός στόχος αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθούν οι μεταβολές στο μεταβολικό δακτυλικό αποτύπωμα μετά τη χορήγηση της TC4 και να εντοπιστούν τα χαρακτηριστικά που μεταβλήθηκαν σημαντικά.Αρχικά, αυτή η μελέτη παρουσιάζει μια απλή και αποτελεσματική μέθοδο απομόνωσης σε ένα βήμα των κύριων δευτερογενών μεταβολιτών ενός εκχυλίσματος κρόκου με μεθανόλη-νερό 50:50 v/v χρησιμοποιώντας χρωματογραφία κατανομής με φυγοκέντρηση (Centrifugal Partition Chromatography-CPC) που εκτελέστηκε τόσο σε dual-mode όσο και σε elution extrusion mode, χρησιμοποιώντας πέντε διφασικά συστήματα διαλυτών. Συνολικά, από όλα τα πειράματα CPC που πραγματοποιήθηκαν, απομονώθηκαν 6185 mg καθαρής TC4 ενώ απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν 15 επιμέρους συστατικά του εκχυλίσματος του σαφράν. Συνεπώς, η μεθοδολογία CPC που αναπτύχθηκε, θεωρήθηκε κατάλληλη προσέγγιση για την ανάλυση του σαφράν τόσο στο εργαστήριο όσο και στη βιομηχανία των φυσικών προϊόντων.Το επόμενο βήμα της τρέχουσας μελέτης περιελάμβανε την ανάπτυξη και την πλήρη επικύρωση δύο μεθοδολογιών με χρήση υγρής χρωματογραφίας υπερυψηλής απόδοσης (Ultra High Performance Liquid Chromatography–UHPLC PDA), σύμφωνα με τις οδηγίες των U.S FDA και EMA, για την ταχεία και ακριβή ποσοτικοποίηση της TC4 και της κροκετίνης (CRC) σε πλάσμα και εγκέφαλο ποντικιών μετά από i.p. χορήγηση. Οι δύο μέθοδοι UPLC PDA εφαρμόστηκαν επιτυχώς για τον προσδιορισμό των CRC και TC4 σε πλάσμα και εγκέφαλο ποντικιών μετά από i.p. χορήγηση TC4 (50 και 150 mg/kg) σε χρονικό διάστημα 0 240 λεπτών. Η επιλογή της i.p. οδού χορήγησης εξυπηρετούσε την παράκαμψη του μεταβολισμού πρώτης διόδου ή/και της γαστρικής υδρόλυσης, γεγονός που ενίσχυσε τη βιοδιαθεσιμότητα της TC4. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι η TC4 ήταν ικανή να διασχίσει τον ΑΕΦ και να αυξήσει τα επίπεδά της στον εγκέφαλο ανεξάρτητα από τον ιδιαίτερα υδρόφιλο χαρακτήρα της. Είναι ενδιαφέρον ότι η CRC δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα δείγμα πλάσματος ή εγκεφάλου, αν και έχει αναφερθεί ότι η TC4 υδρολύεται γρήγορα σε CRC μετά από χορήγηση από το στόμα. Συνεπώς η i.p. χορήγηση θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στην περίπτωση της TC4 ώστε να είναι εφικτός ο ακριβής προσδιορισμός του βιολογικού της ρόλου.Στο τελευταίο στάδιο της τρέχουσας μελέτης, το μεταβολικό δακτυλικό αποτύπωμα και οι σχετικές μεταβολές του μετά την i.p. χορήγηση της TC4 σε αρσενικά και θηλυκά ποντίκια, προσδιορίστηκε με μεταβολομική μελέτη βασισμένη σε φασματομετρία μάζας συζευγμένη με υγροχρωματογραφία υπερυψηλής απόδοσης (UHPLC-HRMS). Στη συνέχεια εφαρμόστηκε πολυπαραμετρική στατιστική ανάλυση (MVA), με σκοπό να προσδιορισθούν τυχόν επιδράσεις της TC4 στο μεταβόλωμα των ποντικιών. Λόγω της μεγάλης μεταβλητότητας που επιβάλλεται από διάφορους παράγοντες, π.χ. το φύλο, η δόση χορήγησης και τα χρονικά σημεία, η ML-(s)PLS-DA αποδείχθηκε η μόνη αποτελεσματική προσέγγιση. Επιπλέον, ανιχνεύθηκε μια φυλοσύνδετη πρωταρχική επίδραση στο μεταβόλωμα των ζώων, υποδηλώνοντας ότι η χορήγηση και στα δύο φύλα είναι απαραίτητη προκειμένου να έχουμε σαφή εικόνα των μεταβολικών αλλαγών. Τέλος, με αυτή τη UPLC-HRMS μεθοδολογία, καταδείχθηκε σαφώς ότι η χρονική αλληλουχία των μεταβολών στο μεταβόλωμα οφειλόταν στη χορήγηση TC4. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που παρήχθησαν από διάφορα στατιστικά λογισμικά, οι επιλεγμένες μεταβλητές εφαρμόστηκαν περαιτέρω σε ηλεκτρονικές βάσεις δεδομένων, ώστε να ταυτοποιηθούν και να εντοπιστούν πιθανοί μεταβολίτες.