Περίληψη
Οι μεταλλάξεις του γονιδίου της γλυκοσερεβροσιδάσης (GBA1) αποτελούν τον πιο συχνό γενετικό παράγοντα κινδύνου για την εμφάνιση νόσου του Parkinson (PD). Επιπλέον, οι μεταλλάξεις του GBA1 έχουν συσχετιστεί με ελαττωμένη ενεργότητα του λυσοσωμιακού ενζύμου της γλυκοσερεβροσιδάσης (GCase) σε ασθενείς με PD, αλλά και ασθενείς PD που δεν φέρουν μετάλλαξη στο GBA1 παρουσιάζουν επίσης ελαττωμένη ενεργότητα της GCase στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Συνολικά, φαίνεται πως η ενεργότητα του συγκεκριμένου ενζύμου διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της PD. Όσον αφορά τον μηχανισμό δια του οποίου μεσολαβείται η συνεισφορά των μεταλλάξεων του GBA1 στον κίνδυνο εμφάνισης της νόσου, είναι πιθανότερα η μεταβολή της λυσοσωμιακής οδού αποικοδόμησης πρωτεϊνών. Η α-συνουκλεΐνη, η πρωτεΐνη που κατέχει κεντρικό ρόλο στην παθογένεια της PD, έχει δειχθεί ότι εκκρίνεται εξωκυττάρια, τόσο ως ελεύθερη πρωτεΐνη, όσο και ως περιεχόμενο των εξωσωμάτων. Είναι πιθανό η δυσλειτουργία του μονοπατιού της ενδοκυττ ...
Οι μεταλλάξεις του γονιδίου της γλυκοσερεβροσιδάσης (GBA1) αποτελούν τον πιο συχνό γενετικό παράγοντα κινδύνου για την εμφάνιση νόσου του Parkinson (PD). Επιπλέον, οι μεταλλάξεις του GBA1 έχουν συσχετιστεί με ελαττωμένη ενεργότητα του λυσοσωμιακού ενζύμου της γλυκοσερεβροσιδάσης (GCase) σε ασθενείς με PD, αλλά και ασθενείς PD που δεν φέρουν μετάλλαξη στο GBA1 παρουσιάζουν επίσης ελαττωμένη ενεργότητα της GCase στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Συνολικά, φαίνεται πως η ενεργότητα του συγκεκριμένου ενζύμου διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της PD. Όσον αφορά τον μηχανισμό δια του οποίου μεσολαβείται η συνεισφορά των μεταλλάξεων του GBA1 στον κίνδυνο εμφάνισης της νόσου, είναι πιθανότερα η μεταβολή της λυσοσωμιακής οδού αποικοδόμησης πρωτεϊνών. Η α-συνουκλεΐνη, η πρωτεΐνη που κατέχει κεντρικό ρόλο στην παθογένεια της PD, έχει δειχθεί ότι εκκρίνεται εξωκυττάρια, τόσο ως ελεύθερη πρωτεΐνη, όσο και ως περιεχόμενο των εξωσωμάτων. Είναι πιθανό η δυσλειτουργία του μονοπατιού της ενδοκυττάρωσης μέσω δυσλειτουργίας της GCase να συμβάλλει σε αλλαγή της έκκρισης εξωσωμάτων και της σχετιζόμενης με εξωσώματα α-συνουκλεΐνης. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να εξεταστεί η αλλαγή στη συσσώρευση και την έκκριση της α-συνουκλεΐνης μέσω χειρισμών στη μορφή και την ενεργότητα του λυσοσωμιακού ενζύμου της GCase. Στο πρώτο στάδιο της διατριβής, κατασκευάστηκαν τέσσερις αδενοϊοί που εμπεριείχαν την αγρίου τύπου (WT), τις μεταλλαγμένες μορφές N370S και D409V της GCase ή το γονίδιο για την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) ως μάρτυρα. Οι ιοί χρησιμοποιήθηκαν για τη μόλυνση πρωτοταγών καλλιεργειών φλοιϊκών νευρώνων από μύες. Η μεσολαβούμενη από αδενοϊό υπερέκφραση της WT GCase οδήγησε σε σημαντική μείωση της έκκρισης εξωσωμάτων in vitro. Η ποσότητα της α-συνουκλεΐνης τόσο ενδοκυττάρια όσο και εξωκυττάρια παρουσίασε τάση αύξησης η οποία δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Στο δεύτερο στάδιο της διατριβής, σε νέα in vitro πειράματα η συμβολή της ενεργότητας της GCase ελέγχθηκε με την υπερέκφραση της α-συνουκλεΐνης μέσω αδενοϊών, παρουσία ή μη του κονδουριτολικού β-εποξειδίου ομοιοπολικού αναστολέα (CBE), εκλεκτικού αναστολέα της GCase. Εκ νέου, παρουσία του αναστολέα CBE, παρατηρήθηκε τάση αύξησης της α-συνουκλεΐνης, που δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Στο τρίτο στάδιο της διατριβής, διενεργήθηκαν in vivo πειράματα. Eπιλέχθηκαν διαγονιδιακοί μύες οι οποίοι ήταν ετερόζυγοι για την μετάλλαξη A53T του γονιδίου της α-συνουκλεΐνης (SNCA). Σε αυτό το μοντέλο ήταν δυνατή η χρόνια αναστολή του ενζύμου της GCase, μέσω της διαπεριτοναϊκής χορήγησης του CBE σε περιοδικά διαστήματα ώστε να προσομοιαστεί η συνεχώς μειωμένη ενεργότητα της GCase σε ασθενείς PD. Πράγματι, η ενδοκυττάρια ολιγομερής μορφή της α-συνουκλεΐνης ήταν στατιστικά σημαντικά αυξημένη στους μύες που έλαβαν τον αναστολέα CBE. Μάλιστα, η αναστολή της GCase προκάλεσε μία αθρόα αύξηση των εγκεφαλικών εξωσωμάτων και της ολιγομερούς α-συνουκλεΐνης που εμπεριέχεται σε εξωσώματα. Στη συνέχεια, για να ελεγχθεί ο ρόλος της μεταλλαγμένης GCase σε ένα χρόνιο μοντέλο της PD, χρησιμοποιήθηκαν ιοί για την υπερέκφραση μεταλλαγμένης GCase στους διαγονιδιακούς για την A53T α-συνουκλεΐνη μύες. Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της διαπίδυσης μπορέσαμε να μετρήσουμε την εκκρινόμενη α-συνουκλεΐνη στο ραβδωτό σώμα ζώντων μυών. Με ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρατηρήσαμε ότι οι μύες που υπερεξέφραζαν την μεταλλαγμένη N370S GCase είχαν αυξημένη έκκριση α-συνουκλεΐνης. Σε περαιτέρω πειράματα στα εν λόγω ζώα, φάνηκε ότι αυτή η αύξηση της έκκρισης της α-συνουκλεΐνης οφειλόταν σε δυσλειτουργία του λυσοσώματος, όπως αναδείχθηκε με ανοσοϊστοχημική χρώση για τον δείκτη αυτοφαγίας LC3.Συνοψίζοντας, η παρούσα διδακτορική διατριβή οδήγησε σε ενδιαφέροντα, καινούρια ευρήματα. Τα αποτελέσματα των ανωτέρω πειραμάτων αποτελούν τα πρώτα στοιχεία για το ότι η μειωμένη ενεργότητα της φυσιολογικής GCase ή η υπερέκφραση μεταλλαγμένης GCase σε ένα χρόνιο in vivo περιβάλλον οδηγούν σε αύξηση της έκκρισης της α-συνουκλεΐνης. Φάνηκε ότι αυτή η μεταβολή οφείλεται, τουλάχιστον εν μέρει, σε δυσλειτουργία της αυτοφαγίας. Αυτή η δράση της GCase μπορεί να οδηγεί σε ενίσχυση της διάδοσης της α-συνουκλεΐνης η οποία με τη σειρά της να συμβάλλει στην εξέλιξη της παθοφυσιολογίας στην PD που σχετίζεται με μεταλλάξεις στο γονίδιο GBA1. Η σχετιζόμενη με εξωσώματα ολιγομερής α-συνουκλεΐνη μπορεί να αποτελέσει θεραπευτικό στόχο αλλά και να διερευνηθεί περαιτέρω ως πιθανός βιοδείκτης. Η μελέτη των παραγόντων που την επηρεάζουν, όπως η GCase, μπορεί πράγματι να έχει κλινική σημασία.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
Glucocerebrosidase gene (GBA1) mutations are the most common genetic contributor to Parkinson’s disease (PD). Moreover, mutations of GBA1 have been correlated with decreased activity of the lysosomic enzyme glucocerebrosidase (GCase) in PD patients, while PD patients not carrying a GBA1 mutation also exhibit low enzymatic activity of GCase in the central nervous system. In total, it seems that the activity of this specific enzyme is an important factor in PD pathogenesis. The most plausible mechanism through which GBA1 mutations contribute to the risk of developing PD is an alteration of the lysosome pathway of protein degradation. α-Synuclein, a protein with a central role in PD pathogenesis, has been shown to be secreted extracellularly, both as a free form protein and in association with exosomes. A dysregulation of the endocytic pathway through the dysfunction of GCase could result in an alteration of exosome and exosome-associated α-synuclein secretion.The aim of this study was to ...
Glucocerebrosidase gene (GBA1) mutations are the most common genetic contributor to Parkinson’s disease (PD). Moreover, mutations of GBA1 have been correlated with decreased activity of the lysosomic enzyme glucocerebrosidase (GCase) in PD patients, while PD patients not carrying a GBA1 mutation also exhibit low enzymatic activity of GCase in the central nervous system. In total, it seems that the activity of this specific enzyme is an important factor in PD pathogenesis. The most plausible mechanism through which GBA1 mutations contribute to the risk of developing PD is an alteration of the lysosome pathway of protein degradation. α-Synuclein, a protein with a central role in PD pathogenesis, has been shown to be secreted extracellularly, both as a free form protein and in association with exosomes. A dysregulation of the endocytic pathway through the dysfunction of GCase could result in an alteration of exosome and exosome-associated α-synuclein secretion.The aim of this study was to examine whether manipulating GCase activity and form both in vivo and in vitro could affect α-synuclein accumulation and secretion.In the first part of this dissertation, four adenoviruses were constructed containing four different genes respectively; wild type (WT) GBA, mutant N370S GBA, mutant D409V GBA and a gene encoding for green fluorescent protein (GFP) as a positive control. The viruses were used to transduce primary cortical neuronal cultures acquired by embryonic mice dissection. The adenovirus-mediated overexpression of WT GCase resulted in a significant decrease of exosome secretion in vitro. Intracellular and extracellular α-Synuclein levels showed a trend of increase that was not statistically significant.In the second part of the dissertation, in new in vitro experiments, the contribution of the activity of GCase to α-synuclein levels was investigated by adding conduritol-B epoxide (CBE), a selective inhibitor of GCase, in the presence of adenovirus-mediated α-synuclein overexpression. A non-significant trend of increase of α-synuclein levels was observed in the presence of CBE inhibition.In the third part of the dissertation, in vivo experiments were performed. Transgenic mice heterozygous for the A53T mutation of the gene encoding for α-synuclein (SNCA) were chosen. In this PD model, a chronic inhibition of the GCase enzyme was achieved by intraperitoneal injections of CBE in specific time intervals. The scheme adopted allowed us to emulate the chronic enzymatic activity decrease of GCase in PD patients. The intracellular oligomeric form of α-synuclein was significantly increased in the mice that received the CBE inhibitor. More specifically, GCase inhibition resulted in profound increase of brain exosomes and oligomeric α-synuclein contained in exosomes. Followingly, in order to examine the role of mutant GCase in a chronic model of PD, adeno-associated viruses were used to overexpress mutant GCase in the striatum of A53T SNCA transgenic mice. Using microdialysis, we were able to measure secreted α-synuclein levels in the same region. Interestingly, mice overexpressing N370S mutant GCase showed an increased secretion of α-synuclein. In further experiments, it was revealed that the α-synuclein secretion increase was due to lysosomal impairment, as observed by immunohistochemical staining for the LC3 autophagy marker.In conclusion, this dissertation resulted in interesting, novel findings. Our results suggest that, in a chronic in vivo model of PD, GCase activity decrease or mutant GCase overexpression result in α-synuclein secretion increase. It seems that this alteration is, at least in part, due to an autophagy impairment. This GCase effect could lead to increased α-synuclein secretion, driving pathology in GBA-associated PD. Exosome-associated oligomeric α-synuclein, apart from a therapeutic target, may also prove to be a relevant biomarker for PD, and thus the study of its modifiers, such as GCase shown here, may prove to be clinically relevant.
περισσότερα