Βιολογικοί δείκτες στη νόσο του Πάρκινσον

Abstract

BACKGROUND: Parkinson’s disease is the second most common neurodegenerative disorder. Reduced expression of lysosomal-associated membrane protein 2a and heatshock-cognate 70 proteins, involved in chaperone-mediated autophagy and of glucocerebrosidase, is reported in PD brains. The aim of this study was to identify systemic alterations in lysosomal-associated membrane protein 2a, heatshock cognate-70, and glucocerebrosidase levels/activity in peripheral blood mononuclear cells from PD patients.Alpha-synuclein aggregation is considered one of the main causes of Parkinson's Disease (PD). Malfunction of autophagy-lysosomal pathways is believed to be an underlying mechanism of α-synuclein aggregation. Although such malfunction has been observed in PD brains, it is unclear whether it may also occur in extraneuronal tissues. Variations of α-synuclein levels or species have been reported in Parkinson's Disease (PD). There has been little systematic examination of erythrocytes, a rich source of α-synuclein. METHODS: Protein/mRNA levels were assessed in PD patients from genetically undetermined background, alpha-synuclein (G209A/A53T), or glucocerebrosidase mutation carriers and age-/sex-matched controls.Total protein degradation in cultured PBMCs was measured by labelling the cells with 3H-leucine using pulse-chase experiments. Different inhibitors were used to measure a range of autophagic pathways. Erythrocyte membranes were obtained from PD patients (mutation carriers in the α-synuclein gene (A53T-PD) and glucocerebrosidase gene (GBA-PD) (n=18 each), and patients without known mutations (GU-PD, n=56)), and age-/sex-matched controls (n=56). Levels of monomeric and dimeric α-synuclein were assessed using Western immunoblotting.Brain tissues isolated from substantia nigra and the frontal lobe were fractionated. A cytosolic and a lysosomal fraction were obtained. RESULTS: Heatshock cognate 70 protein levels were reduced in all PD groups, whereas its mRNA levels were decreased only in the genetically undetermined group. Glucocerebrosidase protein levels were decreased only in the genetic PD groups, whereas increased mRNA levels and decreased activity were detected only in the glucocerebrosidase mutation group. Protein degradation through the main autophagic pathways is reduced in PD patients (n = 18) compared to age- and sex-matched healthy controls (n = 18). A statistically significant increase of α-synuclein dimer and dimer to monomer ratio was found in GBA-PD and GU-PD. In contrast, dimer levels of A53T-PD were not different from controls. No difference was found in α-synuclein monomer levels.Hsc70 protein levels were reduced in the cytosolic fraction of PD patients both in the substantia nigra and frontal lobe. CONCLUSIONS: Reduced heatshock cognate-70 levels are suggestive of an apparent systemic chaperone-mediated autophagy dysfunction irrespective of genetic background. Glucocerebrosidase activity may serve as a screening tool to identify glucocerebrosidase mutation carriers with PD. Lysosomal dysfunction is present in cultured PBMCs of PD patients, suggesting that it may reflect a systemic feature of the disease. The increased α-synuclein dimer in GBA-PD and GU-PD is suggestive of an apparent systemic dysfunction causing the dimerization, and potentially oligomerization, of α-synuclein. These results may have implications for PD pathogenesis and biomarker development.

Η νόσος Πάρκινσον είναι η δεύτερη συχνότερη νευροεκφυλιστική ασθένεια. Παθολογικά, χαρακτηρίζεται από την επιλεκτική απώλεια των ντοπαμινεργικών νευρώνων της συμπαγούς μοίρας της μέλαινας ουσίας του εγκεφάλου και από την παρουσία ενδοκυττάριων πρωτεϊνικών εγκλείστων στα κυτταρικά σώματα και στους νευράξονες, που ονομάζονται σωμάτια Lewy. Η α-συνουκλεΐνη είναι μία άφθονη νευρωνική πρωτεΐνη, η οποία εντοπίζεται στα προσυναπτικά άκρα των νευρικών συνάψεων και εμπλέκεται στην παθογένεια της νόσου Πάρκινσον. Η α-συνουκλεΐνη έχει την τάση να πολυμερίζεται και να δημιουργεί ολιγομερείς μορφές, οι οποίες θεωρούνται τοξικές για τα κύτταρα. Οι πρώτες μεταλλάξεις που συνδέθηκαν αιτιολογικά με την ανάπτυξη της νόσου βρέθηκαν στο γονίδιο SNCA, που κωδικοποιεί την α-συνουκλεΐνη. Σημαντικό ρόλο στην αποικοδόμηση και τον έλεγχο του ολιγομερισμού της α-συνουκλεΐνης διαδραματίζει το μονοπάτι της αυτοφαγίας – λυσοσώματος. Το μονοπάτι αυτό απαρτίζεται από τη μικροαυτοφαγία, τη μακροαυτοφαγία και την αυτοφαγία διαμεσολαβούμενη από σαπερόνες (CMA), με την τελευταία να αποτελεί, πιθανώς, τον κύριο μηχανισμό αποικοδόμησης της α-συνουκλεΐνης. Βασικές ρυθμιστικές πρωτεΐνες της CMA είναι οι Hsc70 και Lamp2a, ενώ της μακρο-αυτοφαγίας οι p62 και LC3. Επίσης, μεταλλάξεις στο γονίδιο GBA, που κωδικοποιεί το ένζυμο β-γλυκοσερεβροσιδάση (GCase), έχουν ενοχοποιηθεί ως προδιαθεσικοί παράγοντες για τη νόσο. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν δείγματα αίματος προερχόμενα από εθελοντές. Απομονώθηκαν μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος (PBMC) και εξετάστηκαν τα επίπεδα των πρωτεϊνών Hsc70, Lamp2a, GCase, p62 και LC3. Συνολικά μετρήθηκαν δείγματα 148 εθελοντών που είχαν χωριστεί σε τέσσερεις ομάδες, υγιείς μάρτυρες (n=56), ασθενείς χωρίς γνωστές μεταλλάξεις που σχετίζονται με τη νόσο Πάρκινσον (n=56, GU-PD), ασθενείς φορείς της A53T μετάλλαξης του γονιδίου SNCA (n=18, A53T-PD) και ασθενείς φορείς μεταλλάξεων στο γονίδιο GBA (n=18, GBA-PD). Τα επίπεδα της Hsc70 εντοπίστηκαν μειωμένα στους ασθενείς όλων των γενετικών κατηγοριών σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Τα επίπεδα της GCase ήταν μειωμένα στους ασθενείς φορείς μεταλλάξεων στα γονίδια SNCA και GBA σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες, ενώ δεν αναδείχτηκαν διαφορές στις υπόλοιπες συγκρίσεις. Σε ένα υποσύνολο των παραπάνω δειγμάτων (n=18 από κάθε μία από τις τέσσερεις ομάδες) έγινε μέτρηση των επιπέδων του mRNA που προέρχεται από μεταγραφή των γονιδίων HSC70, LAMP2A, και GBA. Βρέθηκαν μειωμένα επίπεδα του HSC70 mRNA στην ομάδα των GU-PD σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες, χωρίς να ανευρίσκονται διαφορές στα επίπεδα του mRNA μεταξύ των ομάδων A53T-PD, GBA-PD και των υγιών μαρτύρων. Ακόμη, βρέθηκαν μειωμένα επίπεδα του GBA mRNA στις ομάδες A53T-PD και GBA-PD σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες. Επιπρόσθετα, μετρήθηκε στα PBMC η ενεργότητα της GCase, όπου παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική μείωση της ενεργότητας του ενζύμου στους ασθενείς φορείς μεταλλάξεων στο GBA σε σχέση με τα άτομα των άλλων τριών ομάδων. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε in vitro μελέτη της λειτουργικότητας των διαφόρων μονοπατιών αυτοφαγίας, και πιο συγκεκριμένα της ολικής λυσοσωμικής λειτουργίας, της μακροαυτοφαγίας και της CMA. Μετρήθηκαν συνολικά 36 δείγματα, 18 προερχόμενα από υγιείς μάρτυρες και 18 από ασθενείς με ιδιοπαθή νόσο Πάρκινσον. Διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική μείωση της ενεργότητας των λυσοσωμάτων στους ασθενείς σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Μάλιστα, η μείωση αυτή εμφανίστηκε τόσο στη συνολική λυσοσωμική λειτουργία, όσο και στη μακροαυτοφαγία και τη CMA. Ακόμη, μετρήθηκαν τα επίπεδα της μονομερούς και της διμερούς μορφής της α-συνουκλεΐνης στις μεμβράνες ερυθρών αιμοσφαιρίων. Τα κύτταρα αυτά απομονώθηκαν από αίμα εθελοντών, οι οποίοι είχαν τοποθετηθεί σε αντίστοιχες ομάδες με αυτές που χρησιμοποιήθηκαν στην μελέτη των PBMC. Τα επίπεδα της διμερούς α-συνουκλεΐνης ήταν αυξημένα στις ομάδες GU-PD και GBA-PD σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες, ενώ δεν σημειώθηκαν διαφορές στα αντίστοιχα επίπεδα στην ομάδα A53T-PD συγκριτικά με τους υγιείς μάρτυρες. Τα επίπεδα της μονομερούς μορφής της α-συνουκλεΐνης παρέμεναν σταθερά ανάμεσα στις διάφορες ομάδες. Εν συνεχεία, μελετήθηκε μεταθανάτιο υλικό από ιστούς προερχόμενους από τη μέλαινα ουσία και το μετωπιαίο λοβό εγκεφάλων δωρητών. Οι εγκεφαλικοί ιστοί (n=10 υγιείς μάρτυρες, n=10 ασθενείς με ιδιοπαθή νόσο Πάρκινσον) κλασματοποιήθηκαν και διαχωρίστηκε το λυσοσωμικό από το κυτταροπλασματικό κλάσμα. Στο κάθε κλάσμα και σε κάθε περιοχή μετρήθηκαν τα επίπεδα των πρωτεϊνών Hsc70, GCase, Cathepsin D, α-συνουκλεΐνης και Lamp2a. Στην μέλαινα ουσία ανευρέθηκαν μειωμένα επίπεδα της Hsc70 και της α-συνουκλεΐνης στο κυτταροπλασματικό κλάσμα των ασθενών και αύξηση της Cathepsin D στα λυσοσωμικό κλάσμα. Αντίστοιχα, στον μετωπιαίο λοβό ανευρέθηκε μείωση των επιπέδων της Hsc70 και της GCase στο κυτταροπλασματικό κλάσμα των ασθενών με ιδιοπαθή νόσο Πάρκινσον. Τα επίπεδα των υπόλοιπων πρωτεϊνών, καθώς και των HSC70, GBA και LAMP2A mRNA δεν εμφάνισαν διαφορές ανάμεσα στις δύο ομάδες.Συμπερασματικά, η λυσοσωμική δυσλειτουργία και η συσσώρευση της α-συνουκλεΐνης αποτελούν μια συστημική διαταραχή αφού είναι εμφανείς και σε κύτταρα εκτός του κεντρικού νευρικού συστήματος. Τα επίπεδα των πρωτεϊνών, που σχετίζονται με το μονοπάτι αυτοφαγίας – λυσοσώματος, η ενεργότητα των λυσοσωμάτων και του ενζύμου GCase στα PBMC καθώς και η συγκέντρωση των ολιγομερών μορφών της α-συνουκλεΐνης στις μεμβράνες των ερυθρών αιμοσφαιρίων μπορούν να αποτελέσουν βάση για την ανάπτυξη νέων βιολογικών δεικτών και καινοτόμων διαγνωστικών και θεραπευτικών προσεγγίσεων της νόσου Πάρκινσον.