Ανάπτυξη και χαρακτηρισμός προηγμένων νανοϋβριδικών υλικών

Abstract

The present thesis focuses on the development and characterisation of advancedmicrogel-based nanohybrid materials, intended for use in drug uptake, transportand release for biomedical applications. Poly(N-isopropylacrylamide)(PNiPAm), a biocompatible and thermoresponsive polymer, was selected as themain constituent of the microgel nanocarriers. The copolymerisation of sodiumacrylate provided active carboxylic sites for post-polymerization modificationreactions. In order to achieve optimum properties (hydrodynamic dimensions~200 nm, volume phase transition temperature ~36.7 °C, core/shell morphologyand surface reactivity) to the PNiPAm microgel scaffolds, a novelpolymerization protocol was introduced, where the functional comonomer isparticipating in the polymerization reaction at an instance after the initiation. Theresults were interpreted in the basis of a phenomenological model, whichsuggests that the incorporation of charged residues into the developinghydrophobic (at the reaction temperature) PNiPAm chains, induces a pseudosurfactanteffect thereby stabilising the growing microgel particles. Thehydrodynamic dimensions where measured with variable temperature dynamiclight scattering (DLS) at different pH values. The characterization of the totalcharge and surface reactive sites was realised through the combination ofelectrophoretic light scattering measurements (ELS) with pH-metric andpolyelectrolytic titrations. The optimized microgels were subsequently utilisedfor the development of the final trifunctional nanohybrid materials. Initially, afluorescein derivative with an amino pendant functionality was synthesised andwas covalently attached at the surface carboxyl decorated microgels, viacarbodiimide coupling. Subsequently, the in-situ deposition of γ-Fe2O3 magneticnanophase at the surface of the fluorescent/thermoresponsive materials wasperformed, through the directed coprecipitation of iron salts at the residualcarboxylic active sites. The molecular characterisation included 1H-NMR 13CNMRand FT-IR. The photophysical properties were studied with UV-Vis andfluorescence spectroscopies. The fluorescent and fluorescent/magnetic materialsshowed a noticeable dual optical/thermoresponsive behaviour in respect with pHchanges. Solid state characterization with TGA and VSM yielded the determination of inorganic content and study of the magnetic properties,respectively. In the last stage of the development, the biocompatibility of thenanocarriers was assessed through the uptake from the HeLa cervical cancer cellline and MTT cell viability study. The materials were used further for theencapsulation of the antitumour drug doxorubicin. The cell uptake study of thedoxorubicin loaded nanocarriers revealed the intracellular controlled release ofthe drug. The presence of the magnetic nanophase was found to significantlyaugment the complexation of doxorubicin in the nanocarriers. For the elucidationof the drug release mechanism, in-vitro experiments were conducted, verifyingthat the process is controlled from pH variations and specifically triggered at themildly acidic conditions that hold in the lysosomal cellular compartments.

Η παρούσα διατριβή πραγµατεύεται την ανάπτυξη και τον χαρακτηρισµό προηγµένων νανοϋβριδικών µικροπηκτών µε έµφαση σε τελικές βιοϊατρικές εφαρµογές ενθυλάκωσης, µεταφοράς και αποδέσµευσης ενεργών φαρµακευτικών ουσιών. Το θερµοαποκρίσιµο πολυµερές πολυ(Νισοπροπυλακρυλαµίδιο) υπήρξε το βασικό συστατικό των µικροπηκτών και το ακρυλικό οξύ χρησιµοποιήθηκε ως το δεύτερο δραστικό συµµονοµερές. Για την επιτεύξη των αριστοποιηµένων ιδιοτήτων (µέγεθος ~ 200 nm, θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης ~ 36.7 °C, µορφολογία πυρήνα/κελύφους και επιφανειακή χηµική δραστικότητα) αναπτύχθηκε ένα πρωτόκολο πολυµερισµού κατά το οποίο το δραστικό συµµονοµερές υπεισέρχεται στην αντίδραση σε χρόνο µεταγενέστερο της έναρξης του πολυµερισµού. Για την ερµηνεία των αποτελεσµάτων προτάθηκε ένα νέο µηχανιστικό µοντέλο, σύµφωνα µε το οποίο η εισαγωγή µονοµερικών στοιχείων ακρυλικού νατρίου στις διαδιδόµενες υδροφοβικές (στην θερµοκρασία διεξαγωγής του πολυµερισµού) αλυσίδες τουPNiPAm επάγει ψευδοτασιενεργό δράση και ως εκ τούτου προκαλεί την σταθεροποίηση των αναπτυσσόµενων κολλοειδών. Ο χαρακτηρισµός των υδροδυναµικών διαστάσεων πραγµατοποιήθηκε µε δυναµική σκέδαση φωτός(DLS) µεταβλητής θερµοκρασίας σε διαφορετικές τιµές του pH. O χαρακτηρισµός του συνολικού φορτίου και των επιφανειακών δραστικών θέσεων πραγµατοποιήθηκε µέσω του συνδυασµού µετρήσεων ηλεκτροφορετικής σκέδασης φωτός (ELS) µε pH-µετρικές και ηλεκτρολυτικές τιτλοδοτήσεις. Το αριστοποιηµένο υλικό χρησιµοποιήθηκε ως ικρίωµα για την ανάπτυξη του τελικού τριλειτουγικού νανοϋβριδικού υλικού. Αρχικά συντέθηκε ένα παράγωγο της χρωµοφόρας φθορεσίνη µε φέρουσα άµινο δραστικότητα, το οποίο προσδέθηκε οµοιοπολικά στην επιφάνεια των καρβόξυλο δραστικών µικροπηκτών. Στην συνέχεια ακολούθησε η in-situ εναπόθεση της µαγνητικής νανοφάσης του γ-οξειδίου του σιδήρου στην επιφάνεια των φθορίζοντων µικροπηκτών, µέσω µίας διεργασίας καθοδηγούµενης συγκαταβύθισης αλάτων σιδήρου στις παραµένουσες δραστικές θέσεις. Ο µοριακός χαρακτηρισµός περιελάµβανε την χρήση φασµατοσκοπικών τεχνικών FT-IR, 1H-NMR και 13CNMR.Οι φωτοφυσικές ιδιότητες µελετήθηκαν µε φασµατοσκοπίες φθορισµού και ορατού-υπεριώδους (UV-Vis). Τα φθορίζοντα και φθορίζοντα/νανοϋβριδικάυλικά επέδειξαν αξιοσηµείωτη συµπεριφορά, µε διττή θερµική/οπτική αποκρισιµότητα ανάλογα µε το pH. Τα υλικά χαρακτηρίστηκαν στην στερεά κατάσταση µε θερµική σταθµική ανάλυση (TGA) και µαγνητοµετρία παλλόµενου δείγµατος (VSM) για τον προσδιορισµό του ανόργανου ποσοστού και την µελέτη των µαγνητικών ιδιοτήτων αντίστοιχα. Στο τελευταίο στάδιο της ανάπτυξης, η βιοσυµβατότητα των υλικών ως νανοφορείς αξιολογήθηκε µέσω της πρόσληψης από καρκινικά κύτταρα της σειράς HeLa και την µελέτη της κυτταρικής βιωσιµότητας µε δοκιµή ΜΤΤ. Τα υλικά αξιοποιήθηκαν περαιτέρω για την ενθυλάκωση του αντικαρκινικού φαρµάκου δοξορουβικίνη. Η µελέτη κυτταρικής πρόσληψης των νανοφορέων µε ενθυλακωµένη δοξορουβικίνη απέδειξε την ενδοκυτταρικά ελεγχόµενη απελευθέρωση του φαρµάκου από όλα τα σύστηµατα. Η παρουσία της µαγνητικής φάσης αποδεικνύεται ότι συµβάλλει καθοριστικά στην ενθυλάκωση της δοξορουβικίνης σε πολύ µεγάλο ποσοστό.Για την εξακρίβωση του µηχανισµού απελευθέρωσης, πραγµατοποιήθηκαν δοκιµές in-vitro από τις οποίες επιβεβαιώθηκε ότι η διεργασία απελευθέρωσης ελέγχεται από το pH και συγκεκριµένα πραγµατοποιείται σε ελαφρώς όξινες συνθήκες.