Σύνθεση και χαρακτηρισμός τροποποιημένων πολυλειτουργικών νανοπεριεκτών

Abstract

The aim of this thesis is the synthesis, characterization and biological evaluation of modified multifunctional nanoparticles (MMNs) as drug delivery systems (DDS, with immediate effect in the treatment of breast and prostate cancer. The term nanoparticles (NPs) refer to the particles which are in the nanometer scale and range in size, from about 1nm to and 100 nm. The term multifunctional refers to the properties of these nanostructures and more particularly to the way that change their properties when external factors such as temperature, pH, redox environment and alternating magnetic field are applied.For the preparation of polymeric nanoparticles, different types of polymerizations were used such as, emulsion polymerization, seed polymerization, atom transfer radical polymerization, dispersion polymerization and polymerization through distillation-precipitation process. The different sensitivities were added via copolymerization of different monomers which exhibit the aforementioned properties. Some of the monomers used like, N-(-2-HydroxyPropyl) Methacrylamide (HPMA), which is sensitive to temperature changes and N,N'-(disulfanediylbis(ethane-2,1-diyl))bis(2-methylacrylamide) (Disulfide) which is sensitive to changes in the redox environment, were synthesized in the laboratory, while the rest, were commercially available.The primary monomer, used in the polymerizations, was Methyl Methacrylate (MMA) which is non-toxic and in through to its polymerization creates spherical structures of certain size (nanospheres). By using the specific monomer, copolymers, which are sensitive to temperature, pH and redox environment or a combination of these factors, were synthesized. The synthesized polymeric nanospheres-nanocontainers, are either hollow inside, or form core-shell structures, where the shell contains the monomers with the desired sensitivity. The cavity which is created inside the nanospheres, in some cases, is intended to entrap pharmaceutical substances. The drug molecules used in this thesis, either within or tethered to the surface of the nanospheres are, Doxorubicin (DOX) and Daunorubicin (DNR).The induction of the magnetic properties in nanocontainers was performed by the synthesis of magnetic nanoparticles (MNPs), prepared on their surface. The use of an alternating magnetic field increases the temperature locally resulting on one hand to facilitate local release of the entrapped drug, and on the other hand, because of the high temperatures developed locally, to lead the tumor cell to apoptosis (programmed cell death).For the characterization of nanoparticles a variety of techniques were used. For the morphological characterization, Scanning Electron Microscopy (SEM) and Transmission Electron Microscopy (TEM) were used while for the structural characterization, Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR), Raman Spectroscopy, Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and X-ray diffraction Spectroscopy were used. Magnetic properties were studied by Vibrating Sample Magnetometry (VSM). The Dynamic Light Scattering technique (DLS) was also used in order to get information about the properties and behavior of nanoparticles in solution and Ultra Violet-Visible Spectroscopy (UV-VIS), gave information about Loading and Release of the drugs used in nanocontainers. Hyperthermia measurements were carried out by using an external alternating magnetic field.

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η σύνθεση, ο χαρακτηρισμός και η βιολογική αξιολόγηση τροποποιημένων πολυλειτουργικών νανοπεριεκτών (ΠΝΠ) ως συστημάτων μεταφοράς φαρμάκων (ΣΜΦ), με άμεση εφαρμογή στη θεραπεία του καρκίνου του μαστού και του προστάτη. Με τον όρο νανοπεριέκτες (ΝΠ) εννοούμε τα σωματίδια τα οποία βρίσκονται στην κλίμακα του νανομέτρου και κυμαίνονται σε διαστάσεις από περίπου 1nm έως και 100 nm. Ο όρος πολυλειτουργικά αναφέρεται στις ιδιότητες αυτών των νανοδομών και πιο συγκεκριμένα στο πως μεταβάλλονται οι ιδιότητες αυτών όταν υπάρχει επίδραση εξωτερικών παραγόντων όπως θερμοκρασία, pH, όξειδο-αναγωγικό περιβάλλον και μεταβαλλόμενο μαγνητικό πεδίο.Για την παρασκευή των πολυμερικών νανοπεριεκτών χρησιμοποιήθηκαν διάφορα είδη πολυμερισμών όπως, πολυμερισμός γαλακτώματος μέσω ριζών, πολυμερισμός σπόρου (seed), πολυμερισμός μεταφοράς ατόμου με ρίζες, πολυμερισμός διασποράς και πολυμερισμός μέσω απόσταξης-καταβύθισης. Οι διάφορες ευαισθησίες στα ΝΣ προστέθηκαν μέσω συμπολυμερισμού διαφόρων μονομερών τα οποία παρουσιάζουν τις προαναφερθείσες ιδιότητες. Κάποια από τα μονομερή τα οποία χρησιμοποιήθηκαν, όπως το υδρόξυ προπυλικό μεθακρυλαμίδιο (HPMA) το οποίο παρουσιάζει ευαισθησία στη μεταβολή της θερμοκρασίας και το 3-Μεθυλ-N-(2-((2-(3-οξοβουταναμιδο)εθυλ) δισουλαφανυλ)εθυλ)βουτ-3-εναμίδιο (Disulfide) το οποίο παρουσιάζει ευαισθησία στις μεταβολές του όξειδο-αναγωγικού περιβάλλοντος συνετέθησαν στο εργαστήριο, ενώ τα υπόλοιπα ήταν εμπορικά διαθέσιμα.Το κύριο μονομερές το οποίο χρησιμοποιήθηκε στους πολυμερισμούς είναι ο Μεθακρυλικός Μεθυλεστέρας (MMA) το οποίο είναι μη τοξικό και κατά τον πολυμερισμό του δημιουργεί σφαιρικές δομές συγκεκριμένου μεγέθους (νανοσφαίρες). Με τη χρήση του συγκεκριμένου μονομερούς συνετέθησαν συμπολυμερή, τα οποία είναι ευαίσθητα στη θερμοκρασία, στο pH και στο όξειδο-αναγωγικό περιβάλλον ή σε συνδυασμό των παραγόντων αυτών. Οι πολυμερικές νανοσφαίρες-νανοπεριέκτες οι οποίες συνετέθησαν είναι κενές στο εσωτερικό τους, ή είναι της μορφής πυρήνας-κέλυφος, όπου το κέλυφος περιέχει τα μονομερή με τις επιθυμητές ευαισθησίες. Η κοιλότητα η οποία δημιουργείται στο εσωτερικό των νανοσφαιρών, σε ορισμένες περιπτώσεις, έχει ως σκοπό τον εγκλωβισμό φαρμακευτικών ουσιών. Τα φαρμακευτικά μόρια τα οποία χρησιμοποιούνται στην παρούσα διδακτορική διατριβή, είτε στο εσωτερικό των νανοσφαιρών είτε προσδεδεμένα στην επιφάνεια αυτών, είναι η Δοξορουβικίνη (Doxorubicin) και η Δαουνοροβικίνη (Daunorubicin).Η επαγωγή των μαγνητικών ιδιοτήτων στους νανοπεριέκτες πραγματοποιήθηκε με τη σύνθεση μαγνητικών νανοσωματιδίων (ΜΝΣ) τα οποία παρασκευάστηκαν πάνω στην επιφάνειά τους. Η χρήση ενός εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου αυξάνει τοπικά τη θερμοκρασία με αποτέλεσμα, αφενός να διευκολύνεται η τοπική απελευθέρωση της εγκλωβισμένης φαρμακευτικής ουσίας και αφετέρου, εξαιτίας της υψηλής θερμοκρασίας που αναπτύσσεται τοπικά, να οδηγείται το καρκινικό κύτταρο σε απόπτωση (προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος).Για το χαρακτηρισμό των νανοπεριεκτών χρησιμοποιήθηκε μία πληθώρα τεχνικών. Για το μορφολογικό χαρακτηρισμό χρησιμοποιήθηκε η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης και διέλευσης, Scanning Electron Microscopy (SEM) και Transmission Electron Microscopy (ΤΕΜ) αντίστοιχα, για το δομικό, η φασματοσκοπία υπερύθρου (FT-IR), η φασματοσκοπία Raman, η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) και η τεχνική περίθλασης ακτίνων-Χ,ενώ για τη μελέτη των μαγνητικών ιδιοτήτων χρησιμοποιήθηκε η φασματοσκοπία δονούμενου δείγματος Vibrating Sample Magnetometry, VSM). Επίσης χρησιμοποιήθηκαν η τεχνική της δυναμικής σκέδασης φωτός (Dynamic Light Scattering, DLS) η οποία έδωσε πληροφορίες για τις ιδιότητες και τη συμπεριφορά των νανοπεριεκτών μέσα στο διάλυμα, καθώς επίσης και η φασματοσκοπία ορατού-υπεριώδους (Ultra Violet-Visible, UV-VIS), μέσω της οποίας έγινε μελέτη του εγκλωβισμού και της απελευθέρωσης των χρησιμοποιούμενων φαρμάκων από τις νανoσφαίρες. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν μελέτες υπερθερμίας με τη βοήθεια ενός εξωτερικού εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου.