Ιστικός και ποσοτικός προσδιορισμός των TLRs στο έντερο και στους πνεύμονες σε σηπτικά μοντέλα μυών

Abstract

Introduction: Sepsis is a condition characterized by high mortality rates and often accompanied by multiple-organ dysfunction. During sepsis, respiratory system may be affected and possibly result in acute respiratory distress syndrome (ARDS). Toll-like receptors (TLRs), as a first line defense against invading pathogens, seem to be highly expressed in septic states. Therefore, expression of TLRs in the lungs of a sepsis animal model could indicate the involvement of the respiratory system and appear as a severity index of the clinical course. Once the involvment of TLRs in the septic state is validated, further studies could lead to the development of efficient therapy for sepsis through modulation of the TLRs' function. Aim: To study the expression of TLRs, in the lungs and the intestine of septic mice. Secondarily, to define the role of TLRs in ARDS/ALI and mulitorgan failure. Experimental design: Prospective, randomized, controlled, interventional study. Setting: Center for Clinical, Experimental Surgery and Translational Research, Biomedical Research Foundation of the Academy of Athens, Greece, Subjects: Male C57BL/6J mice, 12 to 14 weeks of age Methods: A total of 90 C57BL/6J mice were studied. The animals were divided into 3 sepsis (S) groups (24h, 48h and 72h) and 3 control (C) groups (24h, 48h and 72h), each consisting of 12 mice. The S-groups were subjected to cecal ligation and puncture (CLP) while the C-groups had a sham operation performed. Blood samples were drawn from all groups. Total blood count analysis was performed along with the measurement of certain biochemical markers. Additionally, lung tissues were harvested and the expression of TLRs, namely TLR2, TLR3, TLR 4 and TLR7 were evaluated by means of immunofluorescence (IF) and qrt-PCR (quantitative-Polymerase Chain Reaction). Results: WBCs and lymphocytes were increased in all S-groups compared to the corresponding C-groups, while RBCs showed a gradual decline in S-groups with the lowest levels appearing in the S72 group. Only, monocytes were higher in S-groups, especially between S48-C48 and S72-C72. Creatinine, IL-10 and IL-6 levels were significantly increased in the S-groups compared to the corresponding C-groups (S24 vs C24, S48 vs C48 and S72 vs C72). IF showed that expression of TLRs 2, 3, 4 and 7 was increased in all S-groups compared to the time-adjusted C-groups. Similarly, qRT-PCR revealed that expression of all TLRs was higher in all S-groups compared to their respective C-groups in both lungs and intestine. Comparing lung and intestinal tissues from S-groups, TLRs 2 and 4 were found increased in the lung at 24, 48 and 72 hours, whereas TLR 3 was higher in the intestine at all time points examined. Finally, TLR 7 levels were significantly higher in the intestinal tissues at 24 hours (p<0.0001), while lungs predominated at 48 hours. TLRs seem to be highly expressed in the lungs of septic mice, therefore suggesting a potential role in the pathogenesis of ARDS during sepsis. While more studies need to be conducted in order to completely understand the underlying mechanisms, TLRs may represent a promising target for establishing novel therapeutic strategies in the treatment of sepsis.

Εισαγωγή: Η σήψη χαρακτηρίζεται από υψηλά ποσοστά θνητότητας και συχνά συνοδεύεται από πολυ-οργανική ανεπάρκεια. Κατά την σήψη το αναπνευστικό σύστημα μπορεί να επηρεαστεί οδηγώντας στην εμφάνιση Συνδρόμου Οξείας Αναπνευστικής Δυσχέρειας (ARDS). Οι υποδοχείς ανάλογοι των Toll (Toll Like Receptors) ως τμήματα της πρώτης γραμμής άμυνας του οργανισμού ενάντια στους παθογόνους μικροοργανισμούς παρουσιάζουν σημαντική έκφραση κατά την σήψη. Η έκφραση των TLRs στους πνεύμονες πειραματόζωων σε κατάσταση σήψης θα ήταν ενδεικτική της συμμετοχής των TLRs στο αναπνευστικό σύστημα και επίσης να αποτελέσουν δείκτη της βαρύτητας και της κλινικής πρόγνωσης. Εφόσον αποδειχθεί η συμμετοχή των TLRs στο πνευμονικό παρέγχυμα κατά την σήψη, περαιτέρω μελέτη θα μπορούσε να καταλήξει στην ανάπτυξη θεραπείας μέσω της μεταβολής της λειτουργίας των TLRs.Σκοπός: Να μελετηθεί η έκφραση των υποδοχέων TLRs σε εντερικούς και πνευμονικούς ιστούς σε σηπτικά μοντέλα μυών. Επίσης να προσδιοριστεί ο ρόλος των υποδοχέων TLRs στο ARDS/ALI και το σύνδρομο πολυοργανικής ανεπάρκειας.Πειραματικός σχεδιασμός: Προοπτική, τυχαιοποιημένη, ελεγχόμενη μελέτη παρέμβασης.Τοποθεσία: Κέντρο Πειραματικής Χειρουργικής, Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών Ακαδημίας Αθηνών.Πειραματόζωα: Άρρενες μύες C57BL/6J ηλικίας 12 έως 14 εβδομάδων. Μέθοδος: Χρησιμοποιήθηκαν 90 πειραματόζωα που χωρίστηκαν σε τρεις σηπτικές ομάδες (ομάδες S) και τρεις ομάδες ελέγχου (ομάδες C). Οι ομάδες S υπεβλήθησαν σε απολίνωση και νύξη του τυφλού, ενώ οι ομάδες C υπεβλήθησαν σε ψευδή επέμβαση. Δείγματα αίματος ελήφθησαν από όλα τα πειραματόζωα ώστε να αναλυθούν για συγκεκριμένους δείκτες. Δείγματα πνευμονικού και εντερικού ιστού λήφθηκαν μετά την ευθανασία στις 24, 48 και 72 ώρες, και εξετάσθηκαν μέσω ανοσοφθορισμού και ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου για την έκφραση των TLR 2, 3, 4 και 7.Αποτελέσματα: Τα λευκά αιμοσφαίρια και τα λεμφοκύτταρα αυξήθηκαν σε όλες τις ομάδες S συγκριτικά με τις αντίστοιχες ομάδες C, ενώ τα ερυθρά είχαν μια σταδιακή πτωτική πορεία στις ομάδες S με την μεγαλύτερη αύξηση στην ομάδα S72. Τα μονοκύτταρα ήταν υψηλότερα στις ομάδες S συγκριτικά με τις ομάδες C και πιο χαρακτηριστικά ανάμεσα στις ομάδες S48-C48 και S72-C72. H κρεατινίνη, η IL-6 και η IL-10 ήταν σημαντικά υψηλότερες στις ομάδες S συγκριτικά με τις αντίστοιχες ομάδες C (S24-C24, S48-C48 και S72-C72). Ο ανοσοφθορισμός έδειξε αυξημένη έκφραση των TLRs 2, 3, 4 και 7 στις ομάδες S συγκριτικά με τις αντίστοιχες ομάδες C. Παρόμοια αποτελέσματα είχε και η ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου για την έκφραση όλων των TLRs που μελετήθηκαν σε δείγματα ιστών πνεύμονα και εντέρου. Συγκριτικά στους δύο αυτούς ιστούς από τις ομάδες S, οι TLRs 2 και 4 ήταν αυξημένοι στον πνεύμονα στις 24, 48 και 72 ώρες, ενώ ο TLR 3 ήταν υψηλότερος στο έντερο σε όλες τις χρονικές περιόδους. Τέλος, τα επίπεδα του TLR 7 ήταν σημαντικά υψηλότερα στο έντερο στις 24 ώρες ενώ στον πνεύμονα η υψηλότερη συγκέντρωση του ήταν στις 48 ώρες. Οι TLRs φαίνεται πως εκφράζονται σημαντικά στους πνεύμονες των μυών σε σήψη, εύρημα που δικαιολογείται από έναν πιθανό ρόλο τους στην παθογένεση του ARDS κατά την σήψη. Παρότι περαιτέρω μελέτες απαιτούνται για να κατανοηθεί πλήρως ο μηχανισμός, οι TLRs θα μπορούσαν να αποτελούν υποσχόμενο στόχο για την δημιουργία νέων θεραπευτικών στρατηγικών στην θεραπεία της σήψης.