Επίδραση ειδικών πρωτεολυτικών ενζύμων στην εξωσωματική παραγωγή και στα ποιοτικά χαρακτηριστικά των εμβρύων αγελάδων

Abstract

Here, we examined the effects of in vitro fertilization (IVF) and in vitro culture (IVC) media modification with the addition of tissue-type plasminogen activator (t-PA) and urokinase-type plasminogen activator (u-PA), respectively, on bovine embryo development and quality, assessed by quantification of various genes’ expression used as markers of embryo viability. Plasminogen activator activity (PAA) and plasminogen activator inhibition (PAI) were measured in all IVF and IVC spent media by a spectrophotometric method. In experiment 1, 2016 cumulus-oocyte complexes (COCs) were divided into 4 groups with modified composition of the IVF medium containing t-PA and/or its inhibitor epsilon-aminocaproic acid (control, t-PA, t-PA+ε-ACA, ε-ACA). t-PA was used at a final activity of 500 IU/ml, while inhibitor’s final concentration was 10 mM. The 2nd experiment is divided into two subgroups, where the effect of IVC medium modification with 5 IU/ml of u-PA is examined on denuded embryos cultured in semi-defined synthetic oviductal fluid (SOF) for seven days (experiment 2.a, 1631 putative zygotes) and on embryos co-cultured on cumulus cells monolayer in serum-containing SOF medium (experiment 2.b, 629 putative zygotes). Relative quantification of all mRNA trancripts was performed using real-time polymerase chain reaction (real-time PCR). To evaluate the quality of produced embryos (Day 7 blastocysts), a set of genes has been selected to be analyzed (PLAC8, AKR1B1, BIRC5 or survivin, BBC3 or PUMA, PΤGS-2 or COX-2, BCL2L1, SLC2A5 or GLUT-5, MnSOD, PLG and PLAUR); their expression is indicative of embryo quality. For Day 3 and Day 4 embryo gene analysis, another group of genes was selected to be studied (BAX, BCL2L1, PIPOX, G6PD, SLC2A5, MnSOD and KAT2B or PCAF). Under our experimental conditions, it appears that exogenously added t-PA to IVF media, suppresses cleavage and bovine blastocyst formation rates. The low IVP rates were reversed, when t-PA activity was reduced by ε-ACA addition. Apoptosis or cell cycle arrest at early stage embryos (morulae) may be favored by this modification reflecting a possible negative effect of t-PA addition on embryo quality. In the 2nd experiment, despite u-PA’s significant role in early and late embryo development, the inclusion of exogenous u-PA in the in vitro bovine embryo culture medium did not have any effect on embryo yield and/or quality under our experimental culture conditions. However, much research is needed to unveil the mechanism by which t-PA and u-PA are involved in in vitro embryo production systems. Even though the above experiments did not favor IVP results and embryo quality, those two activators are definitely involved into fertilization and embryo culture necessitating further investigation of their possible mechanisms and interactions into these processes.

Στην παρούσα διατριβή μελετάται η επίδραση της τροποποίησης των in vitro υποστρωμάτων της γονιμοποίησης (IVF) και της καλλιέργειας των εμβρύων (IVC) με την προσθήκη του ενεργοποιού του πλασμινογόνου του ιστικού τύπου (t-PA) και του τύπου της ουροκινάσης (u-PA) αντίστοιχα, στα ποσοστά παραγωγής των βλαστοκύστεων, αλλά και στην ποιότητά τους, αναλύοντας την έκφραση μιας σειράς γονιδίων που συνδέονται με την ικανότητα ενός εμβρύου να επιβιώσει ή να διακόψει την ανάπτυξή του. Στα υποστρώματα της IVF και της IVC προσδιορίσθηκε η δραστηριότητα των ενεργοποιών του πλασμινογόνου (PAA) και των αδρανοποιών τους (PAI) με τη βοήθεια φασματοφωτομετρικής μεθόδου. Στο 1ο πείραμα χρησιμοποιήθηκαν 2016 συμπλέγματα ωαρίων-κυττάρων του ωοφόρου δίσκου (COCs), τα οποία χωρίστηκαν στην ομάδα των μαρτύρων [control], στην ομάδα της οποίας τα υποστρώματα τροποποιήθηκαν με προσθήκη t-PA, τελική δραστηριότητα 500 IU/ml [t-PA], στην ομάδα που εκτός από t-PA περιείχε και τον αναστολέα ε-αμινοκαπροϊκό οξύ (ε-ACA) [t-PA+ε-ACA], και στην ομάδα που περιείχε μόνο ε-ACA [ε-ACA]. Το 2ο πείραμα περιλαμβάνει δύο υποκατηγορίες πειραμάτων, όπου η επίδραση της προσθήκης του u-PA, σε τελική δραστηριότητα 5 IU/ml, μελετήθηκε σε απογυμνωμένα έμβρυα, τα οποία καλλιεργήθηκαν σε ημι-καθορισμένες συνθήκες (πείραμα 2.α, συνολικά 1631 πιθανά ζυγωτά) και σε έμβρυα, τα οποία καλλιεργήθηκαν σε μη-καθορισμένες συνθήκες και με την παρουσία μίας μονοστιβάδας κυττάρων του ωοφόρου δίσκου (πείραμα 2.β, συνολικά 629 πιθανά ζυγωτά). Η αξιολόγηση της ποιότητας των παραγόμενων βλαστοκύστεων ημέρας 7 έγινε με τη συγκριτική μελέτη της έκφρασης των γονιδίων PLAC8, AKR1B1, BIRC5 ή survivin, BBC3 ή PUMA, PΤGS-2 ή COX-2, BCL2L1, SLC2A5 ή GLUT-5, MnSOD, PLG και PLAUR, των οποίων η έκφραση μεταβάλλεται ανάλογα με την ποιότητα των εμβρύων. Για την γονιδιακή ανάλυση των μοριδίων ημέρας 3 και 4 ελέγχθηκαν τα γονίδια BAX, BCL2L1, PIPOX, G6PD, SLC2A5, MnSOD και KAT2B ή PCAF. Tα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής δείχνουν ότι η προσθήκη εξωγενούς t-PA στο υπόστρωμα της IVF προκαλεί μείωση των ποσοστών αυλάκωσης και παραγωγής εμβρύων βοοειδών. Όταν η εξωγενής αυτή PAA μειώνεται με την προσθήκη του αναστολέα ε-ACA, τα αποτελέσματα της IVP επανέρχονται στα φυσιολογικά επίπεδα. Από την ανάλυση της έκφρασης των επιλεγμένων γονιδιακών μαρτύρων αποκαλύφθηκε ότι, η τροποποίηση με την προσθήκη εξωγενούς t-PA ενδεχομένως επηρεάζει αρνητικά και την ποιότητα των παραγόμενων πρώιμων εμβρύων, καθώς σε αυτά βρέθηκαν να επάγονται φαινόμενα, όπως η απόπτωση και η διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Από την άλλη πλευρά, στο 2ο πείραμα, η τροποποίηση του υποστρώματος καλλιέργειας των εμβρύων με προσθήκη u-PA, δεν επηρέασε την εξωσωματική παραγωγή και την ποιότητα των εμβρύων βοοειδών, είτε αυτά καλλιεργήθηκαν απογυμνωμένα από τη στιβάδα των κυττάρων του ωοφόρου δίσκου και σε υπόστρωμα ημι-καθορισμένων συνθηκών, είτε σε συγκαλλιέργεια σε μονοστιβάδα κυττάρων του ωοφόρου δίσκου και παρουσία ορού. Μολονότι η προσθήκη των δύο ενεργοποιών του πλασμινογόνου στα υποστρώματα της IVP δεν ευνόησε τα ποσοστά παραγωγής των εμβρύων βοοειδών, καθώς και την ποιότητα αυτών, αλλά αντιθέτως τα δυσχέραινε στην πρώτη πειραματική διαδικασία, περισσότερα πειράματα απαιτούνται για τη διαλεύκανση του επακριβούς ρόλου του συστήματος στην IVP. Σε κάθε περίπτωση προκύπτει ότι, οι δυο ενεργοποιοί αποτελούν παράγοντες που συμμετέχουν στη γονιμοποίηση και στην ανάπτυξη των εμβρύων, καθιστώντας ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα την αναζήτηση των πιθανών μηχανισμών δράσης και των αλληλεπιδράσεων τους κατά τη διάρκεια των παραπάνω διαδικασιών.