Μέτρηση απόλυτου αριθμού βιωσιμότητας στον χρόνο και πιθανών παραγόντων ανάπτυξης σε cd34+ βλαστικά κύτταρα ομφαλοπλακουντιακού αίματος σε κυτταρομετρία ροής

Abstract

The isolation of stem cells offers the promise of a remarkable series of new therapeutic methods. Biologic therapies derived from such cells (through regeneration and tissue repair as well as through targeted delivery of genetic material), is expected to be effective in treating a wide range of medical conditions.Diseases such as cancer (the first transplantation of autologous stem cells of the blood has been reported from an American group, in a 3rd year old girl and after 3 years of follow up was found to be healthy and without any indication of disease, (Pediatrics: volume 119, number 1, January 2007), and birth defects are the result of abnormal cell division and differentiation. Understanding these mechanisms will lead us to develop new therapies.In conclusion, cryopreservation and processing UCB units, through the measurement of the absolute numbers of CD34+ cells and their viability, was found to remain stable during the different time periods (24h, 3months, 6months & 1year). The measurement of viability and the absolute numbers of CD34+ cells give us the opportunity for evaluation and control in the processing of umbilical cord stem cells units.Our effort to expand the UCB units and the cells from the umbilical cord opening new areas of research and applications in the field of regenerative medicine.Stem cells are a great promise for use in regenerative medicine and cell therapy in the future.Based on current data, the chances of someone using stem cells throughout life is 1/200, (www.eae.gr), and according to a study in the US one in three chronically ill patients over 65 years old (128 million) will need cell therapy in the coming years. (Nietfeld JJ. Lifetime probabilities of hematopoietic stem cell transplantation in the US Biol. Blood Marrow Transplant. 2008, 14: 316-322).The umbilical cord blood and bone marrow have been proposed as a remedy particularly for blood diseases, malignant and non-malignant tumors of childhood, immune diseases, such as multiple sclerosis and juvenile rheumatoid arthritis. Also, the umbilical cord blood of the children themselves is currently used in clinical trials for the treatment of cerebral palsy and juvenile diabetes, (Duke University Hospital, Dr. Joanne Kurtzberg).The results of these studies are encouraging, but still early, and may help children who have their cryopreservation stem cells stored at birth.Our aim was to evaluate the collection of cord blood while maintaining sufficient progenitor cells to allow for transplantation as well as reduce the risk of microbial contamination during processing.Optimum performance of mononuclear cells remains the most important aspect of cord blood collection. The amount of fetal blood remaining in the placenta and umbilical cord is dependent on a plurality of different factors. The technique of cord blood collection varies between different banks storage and processing, for our study the UCB units collected ectopic.The collection of the placenta is easy and does not disturb the natural course of birth or the postpartum period. In our study we described a simple and effective system for the processing of cord blood in a triple bag collection, which removes 8% of RCB cells and allows the storage of cord blood units in small volumes, units cryopreserved in a final average volume 25ml.In conclusion, the mean absolute number of CD34 + cells was found to be 3,00x106 (n = 4.000), when the threshold value for a transplant is 1.00x105 cells per kilogram body weight.Also, the average viability value was at 90% (n = 4.000), which indicates good techniques followed by cryopreservation and storage of samples. Viability of UBC grafts was tested with trypan blue (n = 4000), and found to be 92% on average. Our results may serve as a control and quality indicators for our method.The presence of erythroblasts in large UCB volumes affects the measurements of WBC cells on a hematology analyzer, but our hypothesis was not observed in our study. We also observed that the low measurements on WBC cells will give us a low number of CD34 + cells in the sample. We also observed a strong correlation between small samples volumes of WBC cells and absolute number of CD34 + cells.To explore possible microbial contamination during processing, we investigated UCB units in a three years period (2008-2010) in absolute numbers, cell viability and infection control, viral serology.In our study we have achieved an increase in the overall yield of nucleated cells after ex vivo expansion using the same combination of cytokines used in the Ueda et al group, except IL-6R.Also, we made a further attempt to culture cells isolated from umbilical cord blood and incubated with fetal cell markers such as Nanog and Oct. Cord blood is an established source for stem cell transplantation procedures. The CD34 + cord blood cells have higher proliferative potential and a higher incidence of long-term repopulating cells in SCID cells.

Η απομόνωση των βλαστικών κυττάρων προσφέρει την υπόσχεση για μια αξιόλογη σειρά νέων θεραπευτικών μεθόδων. Βιολογικές θεραπείες που προέρχονται από τέτοια κύτταρα, (μέσω αναγέννησης και επιδιόρθωσης ιστών, καθώς και μέσω της στοχευόμενης παράδοσης του γενετικού υλικού), αναμένεται να είναι αποτελεσματική στη θεραπεία ενός ευρέος φάσματος ιατρικών νοσημάτων.Ασθένειες όπως ο καρκίνος (1ο μεταμόσχευση από αυτόλογα βλαστικά κύτταρα του αίματος έχει αναφερθεί από μια αμερικανική ομάδα, σε ένα 3χρονο κορίτσι και μετά από 3 χρόνια παρακολούθηση βρέθηκε να είναι υγιής και χωρίς καμία ένδειξη της νόσου, Paediatrics: volume 119, number 1, January 2007), και γενετικές ανωμαλίες είναι αποτέλεσμα της μη φυσιολογικής κυτταρικής διαίρεσης και διαφοροποίησης. Η κατανόηση των μηχανισμών αυτών θα μας οδηγήσουν στην ανάπτυξη νέων θεραπειών. Εν κατακλείδι, η κρυοσυντήρηση και η επεξεργασία ΟΠΑ, μέσα από την μέτρηση των απόλυτων αριθμών CD34+ κυττάρων και της βιωσιμότητας, βρέθηκε να παραμείνει το ίδιο κατά τη διάρκεια των διαφορετικών χρονικών περιόδων. Η μέτρηση της βιωσιμότητας και των απόλυτων αριθμών των CD34+ κυττάρων μας δίνουν την δυνατότητα για αξιολόγηση και έλεγχο κατά την επεξεργασία των βλαστικών κυττάρων ομφαλίου λώρου.Η προσπάθεια πολλαπλασιασμό των μονάδων ΟΠΑ και κυττάρων από τον ομφάλιο λώρο ανοίγουν νέους τομείς έρευνας και χρήσεις τους στον τομέα τις αναγεννητικής ιατρικής.Τα βλαστικά κύτταρα είναι μια μεγάλη υπόσχεση για την χρήση τους στην αναγεννητική ιατρική και την κυτταρική θεραπεία στο μέλλον.Με βάση τα σημερινά δεδομένα οι πιθανότητες να χρησιμοποιηθούν τα βλαστικά κύτταρά του καθ’ όλη τη διάρκεια της ζωής του άνθρωπου είναι 1/200, (www.eae.gr), και σύμφωνα με μελέτη στις ΗΠΑ ένας στους τρείς χρόνια πάσχοντες ασθενείς άνω των 65 ετών (128 εκατ.) θα έχει ανάγκη κυτταρικής θεραπείας στα επόμενα χρόνια. (Nietfeld, Lifetime probabilities of hematopoietic stem cell transplantation in the U.S. Biol. Blood Marrow Transplant. 2008, 14:316-322)Το ομφαλοπλακουντιακό αίμα και ο μυελός των οστών έχουν προταθεί ως μέσο θεραπείας κυρίως για ασθένειες του αίματος, κακοηθών και μη, όγκων της παιδικής ηλικίας, ασθενειών του ανοσοποιητικού, όπως σκλήρυνση κατά πλάκας και νεανική ρευματοειδή αρθρίτιδα. Επίσης, το ομφαλοπλακουντιακό αίμα των ίδιων των παιδιών χρησιμοποιείται σήμερα σε κλινικές μελέτες για τη θεραπεία της εγκεφαλικής παράλυσης και του νεανικού σακχαρώδη διαβήτη,(Duke University Hospital, Dr. Joanne Kurtzberg). Τα αποτελέσματα των μελετών αυτών είναι ενθαρρυντικά, αλλά ακόμη πρώιμα, και αναμένεται να βοηθήσουν παιδιά τα οποία έχουν κρυοσυντήρηση τα βλαστικά κύτταρά τους κατά τη γέννηση. Στόχος είναι η συλλογή ομφαλοπλακουντιακού αίματος, διατηρώντας ταυτόχρονα επαρκή προγονικά κύτταρα για να καταστεί δυνατή η μεταμόσχευση καθώς και να μειωθεί ο κίνδυνος μικροβιακής μόλυνσης κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας. Η τεχνική απομόνωσης τους παραμένει ο πιο σημαντικός παράγοντας της συλλογής ομφαλοπλακουντιακού αίματος. Η τεχνική αυτή εξαρτάται από μια πλειάδα διαφόρων παραγόντων. Η τεχνική της συλλογής ομφαλοπλακουντιακού αίματος ποικίλλει ανάλογα με την εκπαίδευση και την σωστή συλλογή από το εκπαιδευμένο προσωπικό μεταξύ των διαφόρων τραπεζών φύλαξης και επεξεργασίας.Η επικρατούσα τεχνική συλλογής ήταν in utero συλλογή, όταν δηλαδή έχει αρχίσει η σύσπαση της και η ομφάλια φλέβα δίνει αρκετό αίμα. Συμπερασματικά, η αποδεκτή τιμή αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων για μια μεταμόσχευση είναι 1.00x106 κύτταρα ανά χιλιόγραμμο σωματικού βάρους (ΕΟΜ). Επίσης, η μέση τιμή βιωσιμότητας είναι στα 90% (n = 4.000), εξαρτάται από τις καλές τεχνικές που ακολουθήθηκαν κατά την κρυοσυντήρηση και αποθήκευση των δειγμάτων. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ΟΠΑ ελέγχτηκε και με trypan blue (n = 4000) , και είναι 92% κατά μέσο όρο. Τα αποτελέσματα μας μπορούν να χρησιμεύσουν ως δείκτες ελέγχου και ποιότητας για τη μέθοδο μας.Η παρουσία ερυθροβλαστών (erythroblast) σε μεγάλους όγκους ΟΠΑ επηρεάζει τις μετρήσεις των WBC κυττάρων σε έναν αιματολογικό αναλυτή, αλλά αυτή μας η υπόθεση δεν παρατηρήθηκε στην μελέτη αυτή. Παρατηρήθηκε επίσης, ότι οι χαμηλές μετρήσεις σε WBC κύτταρα θα δώσουν χαμηλό αριθμό CD34+ κυττάρων στο δείγμα. Επίσης παρατηρήσαμε ότι σε μικρά δείγματα όγκων υπάρχει ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της βιωσιμότητας των WBC κυττάρων και απόλυτου αριθμού των CD34+ κυττάρων. Η στατιστική ανάλυση επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα της μελέτης.Έγινε επίσης μικροβιακή και ιογενείς ανάλυση των μονάδων που συλλέχθηκαν.Το ομφαλοπλακουντιακό αίμα είναι μια καθιερωμένη πηγή για τις διαδικασίες μεταμόσχευσης βλαστικών κυττάρων. Σε αντίθεση με το μυελό, τα CD34+ κύτταρα από αίμα ομφάλιου λώρου έχουν υψηλότερο πολλαπλασιαστικό δυναμικό, καθώς και μια υψηλότερη συχνότητα της μακροπρόθεσμης ανακατάληψης σε SCID κύτταρα βάση βιβλιογραφίας.